一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。

丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。

调整细胞浓度为5 105/ml。

②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。

2、淋巴细胞增殖反应：将5 105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。

置5％ CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。

37℃培养4-6小时。

4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。

，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。

实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。

转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。

注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。

因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。

（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。

二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。

以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。

(一)主要试剂材料1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。

2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。

所有细胞株均培养在含10%~20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。

(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。

(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 % CO条件下培养，2~3d换液一次。

吸弃1/22上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。

(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞条浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2件下培养，2~3d换液一次。

(四)TIL细胞的分离制备及其诱导(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。

(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。

(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。

(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。

(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。

(6)经1500~1800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。

(7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。

肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。

TIL则用含20% NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 ×106/ml。

(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/温箱培养3~4周，其间3~5d更换或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。

(五)LAK细胞和TIL活性的测定LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。

但所用靶细胞为对NK 不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。

常采用同位素法如51 Cr 释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。

本节介绍MTT比色法。

(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。

(2) LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。

设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。

同时将不同的白血病细胞株分别用20% NCS-RPMI-1640培养液调整至3 ×104一1×105/ml，取100ul 细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。

温箱孵育20h，其余步骤同IL-2 (3)将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2生物活性测定。

(4)细胞毒性百分率(%)按下列公式计算ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值ODT=相应浓度单独靶细胞的OD三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：1) 取小鼠骨髓用BD染色液制成约2×108单细胞悬液2) 阻断：加入Ms Fc BlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞3) 加入Lineage Panel中biotin-mAb, 每种2ml/ 106细胞,冰上15min4) IMag buffer洗涤, 加Streptavidin磁珠, 5ml/ 106细胞, 6-12℃ 30min5) 放入磁场中8min, 将上清小心吸出、收集6) 试管移出磁场, 加buffer重悬阳性片断, 反复吹吸后放入磁场8min7) 小心吸出上清，一并收集8) 重复上两步操作收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞四、IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。

CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。

本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。

检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。

（二）材料（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。

（3）IL-2标准品。

（4）PHA（200ug/ml）。

（三）方法（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。

③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。

（2）IL-2生物活性测定①CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。