2020/8/15
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实验步骤
• 取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1） • 将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管
1）,2000rpm,20min • 将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中
，加入PBS （吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸 管1） （滴管2）.离心之前计数细胞 • 弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为 2*106个/ml. 将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔 • A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养 基，作为空白对照. B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照.
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细胞培养实验的基本要求
• 实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒 1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡 手或用75%酒精擦拭。
• 实验中要求：
Ω一切操作均要在火焰前方进行；瓶口、吸管使用前要经过 火焰消毒后使用。
Ω试剂瓶的瓶口应斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。 Ω专管专用。 Ω手不要从敞开的瓶口上方经过。 • 实验后要求： 关闭超净台风机；用酒精纱布擦拭超净台台面，紫外线消毒 。 2020/8/15
• 形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。 （一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转 化百分率。
（二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体 琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（ Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭ ＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定 OD570的值。
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细胞培养概述
• 细胞培养（cell culture）：从体内取出组织或 细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适 宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结 构和功能的方法。
• 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦 是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。
tube 2 tube 1 Original sample tube
220µL
220µL
450µL
220µL
440µL
10ug/ml
5ug/ml
2.5ug/ml
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注意事项
• 注意无菌操作 • 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 • 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 • 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 • 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 • 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件
实验流程 －－PBMC的分离
• 基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同， 红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞 （淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090； Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分 层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细 胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬 浮于血浆和分层液的界面层中。
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实验流程 －－结果观察
（三）CCK-8(Cell Counting 的甲 臜，且为水溶性。本方法重复性好，灵敏度高，对细胞 的毒性低。
（四）3H-TdR 掺入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是 DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作 为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入 的3H-TdR就越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准 确性好。
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← 血浆 ← ＰＢＭＣ
← 淋巴细胞分离液
← 红细胞、粒细 胞、血小板
实验流程 －－淋巴细胞转化
实验
基本原理： • 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生
增殖； • 有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细
胞发生增殖。
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实验流程 －－结果观察
• T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受 体
★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择 性刺激T细胞增殖；
★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖；
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实验流程
• 分离人外周血单个核细胞（PBMC） • 分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术) • 淋巴细胞转化试验
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• A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养 6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm 值. B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测
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细胞数/ml＝ 4大格中细胞总数 ×104 ×稀释倍数
4
ConA的倍比稀释
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原理
• 淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表 现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成 增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋 巴细胞转化现象（简称为淋转）。
• 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平， 因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
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NaHCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4% Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用 • 培养条件：无菌、３７℃、５％ＣＯ２
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细胞培养基本技术
• 细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代 细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性 。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。
细胞培养条件
• 合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟 合成。 常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。
• 血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。 • 抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。
常用青、链霉素；庆大霉素等。 • 消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液 • pH调整液