淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(3) 过渡型淋巴细胞： 比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ， 核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小 淋巴细胞鉴别要点。

结果判断
(4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大部 分衰变或死亡，呈碎片。



2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类 检查推片头、体、尾三部分，分别计数淋 巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相 细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为 转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下 列公式计算转化率：
操作步骤
外周血0.2ml
PHA 无PHA
5%CO2 37℃
72h
1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片
染色镜检观察细胞形态
操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入 PHA(500g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。混 匀后臵37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天 旋转摇匀一次。 2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心 管中，1500rpm 离心10min。
实验八
T淋巴细胞转化试验
基本原理
刺激物PHA
T淋巴细胞
同位素法 MTT法
增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加
体积变大
胞浆增多、空泡
形态法
淋巴母细胞
核染色质疏松 核仁明显 有丝分裂

检测方法： 形态学计数法 MTT法

同位素法
教学内容：
实验目的 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果判断 注意事项 实验讨论
胞培养液中，可被细胞摄取而掺入到新合成的DNA中。

测定淋巴细胞内放射量，即可判定淋巴细胞转化程度。
试剂与器材



1. 2. 3. 4.


RPMIl640 培养液 。 植物血凝素（PHA）。 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 3H-TdR工作液 以生理盐水稀释成100ci/ml，于4℃ 保存备用。 5．闪烁液 避光保存。 6．器材 96孔细胞培养板、CO2培养箱、49型玻璃纤维滤 纸、多头细胞收集器、β-液体闪烁计数仪、闪烁测量 杯。
1. RPMIl640 培养液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至
7.2～7.4。

2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI
培养液稀释至500～1000g/ml。
试剂与器材

3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压 灭菌器、无菌过滤装臵、离心机、显微镜等。
分离外周血 单个核细胞1106/ ml
100l/孔
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 68h
1500rpm 离心10min
加入MTT 20l/孔
4h
盐酸异丙醇 100l/孔
酶联免疫检测仪A570nm
操作步骤
1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细

四、结果观察

可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的 小淋巴细胞一样为 6 -8 um ，核染色致密， 无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻 度嗜碱性。

淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞： 细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态 不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有 核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空 泡。


胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1106/ ml。 2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100l/孔， 每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔 加含50g/ml的PHA(终浓度5g/ml) 100l， 对照孔加不含PHA的1640培养液100l， 3．混匀后臵37C、5% CO2培养箱内培养68h。

二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验

的原理及其操作方法。
实验原理 一、原理

T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基
噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成
蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或
一、形态学计数法
实验目的

1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。
2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。
实验原理

T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和 核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
试剂与器材

转化的淋巴细胞
未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 细胞大小(直径μm) 12～20 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足 增大、疏松 清晰、1～4个 有或无 增多、嗜碱 有或无 有或无 过渡型 12～16 增大、疏松 有或无 无 增多、嗜碱 有或无 有或无 6～ 8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试

验的原理及其操作方法。
实验原理 一、原理

T淋巴细胞受PHA或特异性抗原刺激后，发生淋巴母细 胞转化，此过程中DNA合成明显增加。此时把氚标记的胸
腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside，3H-TdR）加入细
刺激指数(SI)
注意事项

1.实验过程注意无菌操作。操作时动作要轻柔、 迅速，以免细胞损伤而影响实验结果。 2.淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后2h内进行实验。 3.严格控制实验条件，准确加样。 4.3H-TdR是DNA合成的前体，一般在培养终止前6或16h加 入3H-TdR，被细胞摄取的量高。 5.闪烁液的容水量很低，滤膜必须烘干后方可放入闪烁 液中。
实验。操作时动作要轻柔、迅速，以免细胞损
伤而影响实验结果。
注意事项

3．加入MTT比色法盐酸异丙醇后要在30 min内进 行测定，若规定时间内来不及测定，可将未加 盐酸异丙醇的培养板臵4C保存。测定前取 出，室温静臵10min后再加盐酸异丙醇。
实验讨论

1.试讨论MTT比色法淋巴细胞转化试验的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应 采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细 胞数
100%

在正常情况下， PHA 诱导的淋巴细胞转 化率为 60 ％一 80 ％，如为 50 ％一 60 ％则偏低， 50 ％以下则为降低。
注意事项

1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有 效期。 2 ．小牛血清用前需灭活。 3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。 4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反 应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
操作步骤



4．将培养板1500 rpm离心10min，吸弃上清 液，每孔加MTT20l，混匀，继续培养4h 后，每孔加100l盐酸异丙醇，低速振荡10 min。 5．充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值，测定值为A570nm 减去A630nm的最终结果。
实验讨论

1.本法敏感性高，但影响因素较多，试讨论哪些 因素可对实验结果造成影响？


2.3H (氚)的半衰期长达12年之久，吸入和接触皮
肤都是极有害的。实验中应采取哪些防护措

施，如何处理放射性废液？
溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活
化的程度呈正相关。
试剂与器材

1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装臵、振荡器、酶联免疫检测仪等。
操作步骤
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
实验组A 570-630nm 均值 刺激指数(SI )＝ 对照组A 570-630nm 均值
注意事项

1.实验过程注意无菌操作。由于本实验需要培养3 天才能观察结果。因此，在操作时应避免细菌


污染导致实验的失败。
2．淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后2h内进行
操作步骤
分离外周血 单个核细胞1106/ ml
100l/孔
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
实验组cpm均值 本底cpm值 对照组cpm均值 本底cpm值
操作步骤
3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min， 水洗，干燥。 5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形 态变化，计算淋巴细胞转化率。
结果判断
未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
未转化和转化淋巴细胞的形态特征