微生物的分离、培养和菌种保藏
微生物分离培养和菌种保藏
微生物的分离、培养和菌种保藏
目的要求 实验材料 试验程序 思考题
微生物分离培养和菌种保藏
目的要求
初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏 的基本方法。 练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
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实验材料
样品：新鲜土壤。 培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1 号培养基。 无菌水：装有50mL无菌水三角瓶（配土壤悬液使 用）、装有250mL无菌水三角瓶（梯度稀释使 用）、4支空的无菌试管。 其它：取液器(5000 μl, 1000 μl, 各一支);无菌培 养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、天平、记号笔、 接种环、酒精灯、火柴、水浴锅。
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高氏培养基用于涂布平板（梯度稀释法取 0.2ml，用推棒推匀）（浅色培养基） 牛肉膏培养基用于划线分离（分离所使用 的污水在试管架的试管中）
微生物分离培养方法—斜面接种法）
左手平托两支试管，拇指按住试管底部。外侧使是菌种 试管，内侧是待接的空白斜面。（两支试管的斜面同时 向上），右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有 可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心 将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然 后让试管口缓缓过火焰。 将已灼烧过的接种环伸入外侧的菌种试管内。先冷却， 而后再用环沾取一定量的菌苔，将沾有菌苔的接种环抽 出试管。
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图－1 土壤稀释液的制备和稀释液的取样
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微生物的分离—平板涂抹法
每组取无菌培养皿2付。在皿底贴上标签，注明分离 菌名、稀释度、组别、班级。 凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀释 液0.2mL放在平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒 置于28～30℃条件下培养6～7d，观察放线菌菌落 形态及计数菌落，并计算出每g土壤中放线菌的数量 （方法同上）。 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果 不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。
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微生物的分离—平板划线法
每组取无菌培养皿1付，在皿底贴上标签，注明事项。取已熔化 的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（10－5或10－6）在平板上 划线（教师作示范）。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续 划线。完毕后，倒置于28～300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在 培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C 角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作 第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖 上皿盖，倒置于28～300C温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
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迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部， 轻轻向上划线（直线或曲线）。 接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即 塞入试管内。 将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼， 使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，使菌体爆 溅，造成污染。 放下环后，再将棉塞旋紧，在试管斜面上距试管口2～ 3cm处贴上标签。 28～37 ℃ 恒温培养。
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实验程序
微生物的分离 微生物的接种方法（示范） 微生物培养中的氧气条件 微生物的菌种保藏方法 四大类微生物菌落形态的比较和识别
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实验程序1
（微生物的分离）
用平板涂抹法分离土壤中的放线菌 用平板划线法分离污水中的细菌
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微生物的分离—稀释平板法
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无菌操作简介
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微生物的接种方法—液体接种和穿刺接种
液体接种法：包括从斜面菌种接入培养液，或从液体菌 种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但 在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种， 同时要求无菌操作。 穿刺接种法：用接种针经火焰灭菌后，沾取少量菌种， 垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接 种线将针拔出，要做到手稳、动作轻巧迅速，最后塞上 棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。
制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤0.5g，放入50mL无菌水的三角瓶中，振荡 10min，即为稀释10－2的土壤悬液。 2. 另取装有4.5mL无菌水试管4支，用记号笔编上10－3、10 －4、10－5、10－6。取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取0.5mL土壤悬液加入10－3的无菌水 的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成 10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 、10－5、10－6 土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，应用一支吸管由浓到稀，稀释到底， 稀释方法见图-1。
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实验程序3
（微生物培养中的氧气条件）
参观培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液 体发酵——摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体 振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、 化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧 气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物 理并用的方法。厌氧培养罐（图－9），以某种气体取代培养 容器中空气，并添加还原剂，如产气袋法和换气法。在进行 厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实 验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。