4.在倒平板的过程中，如果不小 心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部 位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与 皿底之间的培养基上滋生，因此最 好不要用这个平板培养微生物。
2、接种
⑴平板划线法
交叉划线法
连续划线法
1、将接种环放在 火焰上灼烧，直 烧红 到接种环_______
鉴别培养基
用于鉴别不同类型微生物的培养基， 微生物产生某种代谢产物，与培养基 中的特殊化学物质发生特定的化学反 应，产生明显的特征变化
3、基本营养
碳源、氮源、能源、生长因子、水、无机盐 无机碳源： CO2、CO3 -、HCO3 ⑴碳源 有机碳源： 牛肉膏、蛋白胨等
2 -
自养微生物 异养微生物
＋、NO 无机氮源： NH 4 3 ⑵氮源 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等
三.无菌技术：
泛指在培养微生物的操作中， 防止外来杂菌的污染的方法
1.灭菌： 使用强烈的理化因素杀死物体内 外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
灼烧灭菌
干热灭菌箱
高压蒸汽灭菌锅
2、消毒
使用较为温和的物理或化学方法杀 死物体表面或内部的部分微生物（不包 括芽孢和孢子）。
煮沸消毒法：100 ℃ 5-6min
5、清洗血球计数板 计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，切勿用硬 物洗刷，洗完后电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉 淀。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
3、计数方法
所统计的中格的总菌数A，菌液的稀释倍数为B，则1ml菌液中： (1) 25个中方格的计数板计算公式

总菌数
（一）直接计数法
——显微镜直接计数法
将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放 在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微 生物数目来计算出体积内的微生物总数。一般适用 于纯培养液悬浮液中单细胞菌体的计数。

优点：直观、快速、操作简单 缺点：


不能区分死菌与活菌，所得为总数，结果往往偏高 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度 个体小的细菌在显微镜下难以观察
（1）细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30-300个 菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有10-100个菌落为宜。 （2）每个稀释度取3个平板平均值，同稀释度的三个重复 对照的菌落数不应相差很大。
（3）由10-4、10-5、10-6稀释度计算出的总活菌数也不能 相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
活菌数/ml＝ 同一稀释度3次重复菌落平均数 ×稀释倍数 培养菌类时所用的稀释液体积
经过培养，由单个微生物生长繁殖而形成肉眼可见的菌落， 即一个菌落代表样品中的一个微生物个体。统计培养基中的出 现的菌落，即可推算出样品中的活菌数。
优缺点：

能检测活菌数和杂菌数 时间长，繁琐，测定值时常受各种因素影响 由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所
以，长成一个单菌落也可能来自样品中的2-3或更
2、在_______ 火焰 旁 冷却接种环，并 打开棉塞
3、将试管口通过火焰
7、灼烧接种环，待其冷却后， 从第一区域划线的_______开 末端 始往第二区域内划线。重复以 上操作，在三、四、五区域内 划线。注意不要将最后一区的 划线与第一区相连。
冷却 的接种环 4、将已______ 伸入菌液中蘸取一环菌液
3、加样 取洁净的血球计数板一块，盖上盖玻片。将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取 少许，沿盖玻片边缘滴入一小滴，让菌液利用液体的表面张力充满计数区， 静置5min。 注：取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生
4、显微镜计数（以16小格 ×25中格的 规格为例） 在高倍下(40X)计数对两个计数室记数，方法：每个计数室选5 个中格(4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数，求得每个中 方格的平均值，再乘上25即为大方格中的总菌数，最后换算成1ml 菌液中的总菌数。 注：依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数 计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体 一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜 计数的结果是两个计数室所记菌数的平均值
2、分类
化学成分不恒定的天然有机物 按 成 分 不 同 划 分 天然培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁 培养基。用于工业生产
合成培养基
化学成分完全了解的物质配 制而成的培养基 高氏1号培养基、查氏培养 基。用于分类和鉴定
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使
其成为固体状态，琼脂含量一般为 按 物 理 状 态 不 同 划 分 1.5%-2.0%，固体培养基常用来进行微 固体培养基 半固体培养基 液体培养基 生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保 藏 琼脂含量一般为0.2%-0.7%，观察 微生物的运动特征、分类鉴定及 噬菌体效价滴定
原生动物
微生物的分离和纯培养技术是微生
物最基本的实验技术，它包括培养 基的制备、灭菌和消毒、接种、培 养等步骤
内容提要：
微生物及其分类
培养基与各类营养物质
无菌技术
菌落
大肠杆菌的纯化培养
微生物数量的测定
二、培养基 1、概念
人们按照微生物对营养物质的 不同需求，配制出供其生长繁殖的 营养基质。
不加任何凝固剂，大规模工业生产及在 实验室进行微生物的基础理论和应用方 面的研究
按 用 途 不 同 划 分
基础培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的基本营 养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）
选择培养基
用来将某种或某类微生物从混杂的微 生物群体中分离出来的培养基，在培 养基中加入相应的特殊营养物质或化 学物质，抑制不需要的微生物的生长， 有利于所需微生物的生长
巴氏消毒法：70-75 ℃ 30min或80 ℃ 15min 化学药剂消毒法：酒精、氯气 紫外线消毒：实验前30min超净台
消毒方法
煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂（70%酒精等） 紫外线 灭菌方法
针对不耐高温的液体 接种室、超净工作台 接种工具（接种环等） 培养皿等玻璃器皿 实验操作者的双手 实验操作者的衣服 培养基
及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染 环境和感染操作者。
⑵稀释涂布平板法 a.梯度稀释菌液：
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
101
102
103
104
105
106
菌液
6支试管，分1ml菌悬液
灼
微量 移液器
滴
涂
试
(3)稀释混合平板法（课本P14)
Pour plate
注： 只有一个稀释度，平均菌落数在30-300之间，以平均菌落数计算
可以用手触摸盛有培养基的锥 形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚 刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通 过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的 微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结 水珠，凝固后的培养基表面的湿 度也比较高，将平板倒置，既可 以使培养基表面的水分更好地挥 发，又可以防止皿盖上的水珠落 入培养基，造成污染。
鉴别培养基:

加入伊红美蓝琼脂培养基（EMS培养基） 鉴别大肠杆菌 现象：蓝紫色金属光泽
4.培养基要满足微生物对环境条件的需求 ：
真菌 细菌 放线菌 微酸性（5.0-6.0） 中性（6.5-7.5） 微碱性（7.5-8.5）
pH： 温度：
大多数微生物适宜生长的温度在25-40℃之间
氧气： 厌氧菌需提供无氧条件
计数室容积
计数室边长为1mm，则计数
区的面积为l×1＝1 mm2，盖 上盖玻片后计数室高度为 0.1mm，所以一个计数室的体 积为l×0.1＝0.1mm3。 (注意：1 ml ＝ 1000 mm3 )
2、操作步骤
1、稀释 用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液。 2、镜检计数室 加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物，则用自来水冲洗， 95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。
灼烧法
干热灭菌
能耐高温的，需要保持干燥的物品
高压蒸汽灭菌
四、菌落
固体培养基上 1.定义： 单个 或少数菌体 大量繁殖 2.特征： 大小、形状、光泽度、 颜色、透明度等。 3.功能： 鉴定菌种的重要依据 子细胞群体
五、微生物的分离和纯培养
分散成单个细胞,形成单个菌落
1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（大肠杆菌分离和纯培养）
第一章 微生物培养技术
微生物:
1、特点
结构都相当简单，个体多数十分微小，通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有 的甚至没有细胞结构。
2、类群
病毒（无细胞结构、寄生生活）
细菌
电子显微镜下的结核杆菌
放线菌
真菌
青霉菌
酵母菌
原生生物
病 细
毒 菌
无细胞结构
2、类群
放线菌 真 菌
原核细胞
真核细胞
计算、称量（配制固体培养基要加入琼脂）
溶化
调pH(注意：灭菌前调PH) 分装、包扎 灭菌（高压蒸汽灭菌） 倒平板
倒平板技术
在火焰旁打开 锥形瓶 使瓶口迅速 通过火焰
1
2
打开一条稍大于 瓶口的缝隙，向培养皿 中倒入 约10-20ml倒入 培养皿，立即盖上皿盖。
3 4
等待平板冷却凝固 后倒置
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃ 左右时，才能用来倒平板。你用什么办 法来估计培养基的温度？
凝固剂
提供碳源、氮源、能源、生长因子
碳源、氮源、生长因子 无机盐 水、溶剂
H2O 定容至1000ml
1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方
延伸：
选择培养基 应用
加入青霉素