免疫学实验-血清学反应
微生物学与免疫学教研室
【基本要求】
• 1. 上实验课时,把个人的书包和衣物放在衣 柜内,穿好白大衣。随身只带必要的实习指导 、笔记本和文具。实验室内禁止饮食。 • 2. 用过的实验材料,放于指定地点,不得随 意抛置。 • 3. 注意节约实验试剂,爱护实验器材。损坏 器材时,应立即报告指导教师,听候处理。 • 4. 实验结束后,将实验台整理清洁,方可离 开实验室。值日同学打扫好室内卫生并检查水 、电、等开关是否关好,防止意外事故发生。
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(四)补体溶血:红细胞与相应抗体结合,
可激活补体使红细胞溶解,称为补体溶血反 应或免疫溶血反应。 原理:补体激活的经典途径(补体的动画) 补体特点: 补体可与任何抗原抗体复合物结合,但不能 单独与抗原或抗体结合。在有特异抗体存在 时可以溶解细胞(溶菌或溶血)。
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溶血反应
RBC
+
RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清(补体)
抗原抗体复合物
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• 4、阶段性:抗原抗体反应分两个阶
段:
① 抗原抗体发生特异性结合的阶段,反应 快,几秒或几分钟,不可见 ② 可见阶段,短至数分、数小时,长至数 日,出现凝集、 沉淀和细胞溶解等现 象
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交叉反应(cross reactions)
概念:两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结 构的抗原表位,可与彼此相应的抗血清发生反应。
B
抗原抗体交叉反应示意图
亲缘关系越近,交叉反应的程度也越高
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三、血清学反应的影响因素
1、反应物自身因素
*抗原:理化特性、Ag决定簇数量和种类。
*抗体:1、来源
2、特异性与亲和力
3、浓度
比例要合适
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2、环境因素:
(1)电解质
作用:中和胶体表面电荷,破坏水化层,
使Ag〃Ab聚集。
常用:0.85%NaCl溶液、缓冲液、Ca2+、Mg2+等。
抗体的两个Fab段 分别 结合两个Ag分子, 相互 交叉结合连接成巨 大的网格状立体聚 合物,(可见)。
Ab/Ag过剩 过剩方的结合价得不到饱和,大 多数游离存在,只形成小分子复 合物(不可见)。
四、传统的血清学反应
1、凝集反应
2、沉淀反应
3、补体参与的溶血反应 4、中和试验
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(一)凝集反应
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实验内容
直接凝集试验
双向扩散试验 补体溶血试验 观看细胞免疫的示教片
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教材P299
• 一、直接凝集试验——试管法(1份/人)
• 试管法凝集试验是一种半定量的试验方法,是在 试管内将抗原或抗体稀释不同倍数后加入等量的 待检抗体或抗原,根据每管内的凝集程度,判定 待检样品中相应抗原或抗体的有无及其效价。 • 试验中可能由于电解质浓度或pH 值不适宜等原 因,而引起抗原非特异性凝集,出现假阳性反应 ,所以应设立阴性对照管。
AFP-Ag
定 位 标 记 孔
待测1
待测2
AFP-Ab
注意:加样量力求准确,勿使样品外溢或在孔缘上 残存小汽泡,以免影响扩散结果。 44 原则:满而不溢
免疫学实验 二
——————— 续血清学反应
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一、分析上次结果
(一)血球凝集(直接凝集试管法):观察结果
并分析 1、从温箱中轻轻取出试管架, 不要摇动试管。先观察对照管 (第7管),此管血球不出现凝 集现象,红细胞在管底自然沉 降呈现点状结构,上层液基本 清澈透亮,管底可见红细胞沉 积物,呈圆形,边缘整齐,轻 轻振摇试管后,可见红细胞浮 起又分散仍呈悬液。
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1、酶免疫测定(Enzyme immunoassay,EIA)
• 用酶标记的抗体或抗抗体来进行的抗原抗 体反应。 • 用酶作标记物 • 由于酶的催化作用可使原来无色的底物通 过水解、氧化或还原反应而显示颜色。
原理(以间接性ELISA为例):
显色
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2、放射免疫测定法(RIA):
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3、免疫荧光技术
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④免疫电泳 ⑤对流免疫电泳
在pH8.6的琼脂凝胶中,抗体球蛋白泳向负极;而 一般抗原蛋白质泳向正极
抗原和抗体将在两孔之间相遇,
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• (三)中和反应:特异性抗体抑制多
种抗原的生物学活性(细菌外毒素的毒 性、酶的活性、病毒的感染性等)的反 应。 • 主要用于毒素的鉴定、病毒感染性疾病 的诊断以及病毒的鉴定。例如在临床实 验诊断中测定风湿病患者体内的抗链球 菌 O抗体的反应。
• 4. 各管加入绵羊红细胞悬液 0.5ml,于是各管血 清稀释倍数又增加了一倍。 • 5. 将各管震荡均匀,放入37℃温箱中过夜,次日 观察结果。
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• 二、双向扩散试验——检测血清中的AFP(1份/2人)
• 【操作方法】 • 1. 双向琼脂扩散试验抗原抗体孔位置如下图所示 • 2. 用微量加样器孔中分别加抗甲胎蛋白诊断血清,周围孔 中分别加入待测血清和阳性对照血清,每孔加入25-30μl。 • 3. 将琼脂板放入密闭的盒内(内放浸有5%石炭酸的纱布以 保持湿度),置37℃温箱中,于24小时后观察结果。
溶血
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由抗原抗体复合物结合C1q启动的途径
• 1. 激活剂 Ag-Ab复合物(IgG1,IgG2,IgG3,IgM) • 2. 参与成分 C1~C9 • 3. 激活过程(三个阶段) • 识别阶段 活化阶段 膜攻击阶段
五、现代免疫标记技术
免疫标记技术(Immuno-labelling technique) 是指将抗原或抗体用荧光素、酶、放射性同 位素和电子致密物质等加以标记,借以提高 其灵敏度的一类新技术。 • 优点:特异性强、灵敏度高、应用范围广 、反应速度快、容易观察、能定位、定量甚 至定位。
此时自第一管至第七管血清的稀释倍数分别是1:10, 1:20,1:40……1:320,具体稀释方法可参阅下图。 42
血清0.1ml
0 .5
0 .5
0 .5
0 .5
0 .5
0 .5
生理盐水 血清稀释度
0.9
0.5
0.5
0.5
0 .5
0.5
0.5
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
弃 之
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2、试验管从第一管看起,管底有凝集块,边缘不 整或卷起等现象,均为阳性反应,分别用( ++++)、(+++)、(++)、(+)表示凝集程 度。 • (++++)表示血球100% 凝集,红细胞形成片层 凝集,均匀布满管底或边缘皱缩如花环状; • (+++)表示血球75% 凝集,红细胞形成片层凝 集,面积略多于(++); • (++)表示血球50% 凝集,红细胞形成片层凝 集,面积较小,边缘较松散; • (+)表示血球25%凝集,红细胞沉于管底,周 围有散在的少量凝集。
原的PI时,引起的抗原非特异性自身凝集现象。
(3)温度—影响反应速度
一般:15~40 ℃为宜,
最适温度:37℃
过高(>56): Ag-Ab解离, Ag、Ab变性, 补体失活。 冷凝集实验:4 ℃凝集,>20解离。 (4)其他 适当的振荡、搅拌等可加速反应
只有抗原与抗体呈适当比例时,才可出现可见的结合反应。
坐标(对数坐标),绘制标准曲线, 求出待检样品内抗原浓度
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③双向扩散:
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝 胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比 例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生 成白色沉淀线.
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(1) 沉淀线吻合:待检抗原与 标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切:待检抗原中 含有与标准抗原相同的抗原, 还含有另外的抗原与抗血清 相对应。 (3) 沉淀线相交:待检抗原有 与抗血清对应的抗原,但和 标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合:待测抗 原和标准抗原性质相同,但 含量较低。 A1:待检抗原;A2:标准抗原
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不同病人抗原浓度测定
1.测定沉淀环直径
通过标准品绘制标准曲线
2.在标准曲线上查找相允许各种Ag或 Ab自由扩散,由近及远形成浓度梯度。
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②火箭免疫电泳
火箭免疫电泳是单向单 扩散和电泳技术相结合 的一种血清学试验,是 让抗原在电场的作用下, 在含有抗体的琼脂中定 向泳动,二者比例合适 时形成类似火箭样的沉 电泳完毕后,观察琼脂板上沉淀 淀峰。沉淀峰的高度与 峰,并测量从孔中心到峰尖的高 抗原的浓度成正比 。 度。以峰高为纵坐标,浓度为横
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血型鉴定
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(2)间接凝集反应(3)间接凝集抑制试验
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(二)沉淀反应
• 1、概念:可溶性抗原+抗体→沉淀现象。
• 可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、 菌体裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、组 织浸出液等)与相应的抗体结合,在适量电 解质存在下,形成肉眼可见的细微的白色沉 淀。
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2、分类 (1)液相中的沉淀反应: 环状沉淀、絮状沉淀 (2)凝胶扩散: ①单向扩散:
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•材料:1% 新鲜绵羊红细胞悬液、羊红细胞凝集素(兔抗绵羊红
细胞免疫血清)等
•方法:(理解对倍稀释法) 1. 取小试管7支,置于试管架上,编号。 2. 用 1ml 刻度吸管吸生理盐水,第一管加0.9ml,其余 管各加0.5ml。 3. 用 1ml 刻度吸管吸取兔抗羊红细胞血清0.1ml 加入 第一管 中,反复吹吸三次,使之与盐水混匀,吸出 0.5ml注入第二管。同样混匀后吸取0.5ml 注入第三管, 依此类推。自第6管吸出0.5ml 弃掉。第八管不加血清作 为对照。
1、定义: • 颗粒性抗原(如细菌、红血球等) +抗体→凝集 现象。