1990s 2000s 2010s 2020s
NAAT ELISPOT, QuantiFERON, LPA, GeneXpert ???
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3.结核病的实验室诊断
细菌学
血清/免疫学
分子生物学
涂片： 敏感性低
传统固体培养： 所需时间长， 2~3月
液体培养及药 敏试验：平均 时间20天
血清学： 存在抗原 纯度和特 异性差等 方面的问 题
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当前结核研究的热点
• 新型抗结核药物(50%) • 新型快速诊断技术(40%) • 新型结核疫苗(10%)
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近期结核病诊断方法的相关研究
JID 2012:205 (Suppl 2), S147.
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7/45
2.结核病的病原学
✓ 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引 起人类结核病的主要病原体。
率较高，此技术已趋向淘汰
瓶外检测技术
瓶内检测技术 易导致污染及生物安全问题
15－21天
不详
无药敏试剂提供
只有3种一线药物 21
BACTEC™ MGIT™ 960/320
指示器系统
阴性培养
阳性O2
CO2 O2 CO2
O2 O2
FFFOOF22OFF2FOO22FFFOO22
初染
石炭酸金胺O
脱色
盐酸酒精
复染
高锰酸钾
显微镜检查
登记/报告
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萋尼氏染色镜下形态
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荧光染色镜下形态
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LED Fluorescence microscopy
LED荧光显微镜
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LED 荧光显微镜
• 成本低廉的超亮发光二极管 • 可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜 • 寿命长（~ 15-20,000小时） • 省电 • 可用电池供能 • 可靠性更强 • 不需要空调设施 • 不需要暗室 • 诊断性能优于标准荧光显微镜 • 操作人员工作负荷减轻
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生长特点：
生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内 约需要15～20小时，在静脉感染未经 免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬 细胞内约需要15～20小时，在家兔角 膜中约需要20～22小时。
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实验室检查方法的历史
1880s
1900s 1920s
1930s 1940s 1950s
Tubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法 Mantoux test (TST with tuberculin) Petragnani medium Purified Protein Derivative（PPD） Lewenstein-Jensen 培养基 Dubos agar, Ogawa 培养基 Middlebrook 7H9
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2011 WHO tuberculosis control report
我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一 2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态
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全球的结核病患者,在接受治疗 之前已经传染给了别人！！！
早期快速诊断与治疗成为制 约结核病控制的关键：有细
菌学诊断依据的病人不超过50%
专业分枝杆菌检测系统 业内金标准 960个检测位 每年可至少检测8000个样本 25~30个
荧光增强法：采用敏感性较 强的荧光信号探测氧气的变 化情况，只需单一反应，所 以速度快，准确性高
瓶外检测技术
8－11天
5种一线抗TB药物，全部具 有FDA及SFDA认证
普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件
IGRA： 有望替代 TST，但 不能区分 活动性TB 与潜伏感 染
TB-DNA TB-mRNA
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①.细菌学诊断
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我国目前最常用的结核病实验室诊断技术
萋尼氏染色
荧光染色
罗氏培养/ 药敏试验
快培/药 敏试验
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光学显微镜检查
碱性复红 盐酸酒精
亚甲兰
显微镜检查 荧光显微镜检查 涂片 ► 干燥 ► 固定
240个瓶位 每年可检测2000个样本
普通细菌血培养系统 需加装分枝杆菌培养特殊组件
528个瓶位
6~7个
9个
PH值比色法：当培养瓶内
有微生物生长，其释放出的 CO2，经水饱和后，产生H+， 使PH值产生变化，感应器的
颜色也随之变化。需双重反
应，因此速度较慢，假阳性
压力检测：检测细菌生长中各 种气体产生和消耗而引起的瓶 内压力的变化。灵敏度差。此 技术已趋向淘汰
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普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较 （不同实验室的结果进行汇总与平均）
显微镜
普通荧光显微 镜
方法
灵敏度 (%)
直接涂片 67.4
普通荧光显微 浓集涂片 66.6 镜
发光二极管 荧 直接涂片 71.6
光显微镜
(p=0.1025)
发光二极管 荧 浓集涂片 72.4
光显微镜
(p=0.0073)
结核病的实验室诊断
1
主要内容
1 结核病的流行情况 32 结核病的病原学 3 结核病的实验室诊断 34 结核病的分子药敏
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1.结核病的流行概况
✓ 全球范围内结核病疫情急剧恶化 • 人口大规模流动 • 结核菌耐药现象益发严重 • 结核病合并艾滋病感染 ✓ 我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国 • 结核菌感染率44.5% • 新发活动性结核患者130万/年 • 死亡13万/年
特异度 (%) 96.1 99.2 96.4 98.8
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生产厂家
培养/药敏试验
Bactec®MGIT 960/320
美国BD公司
Bact/Alert 3D
法国生物 梅里埃公司
VERSA TREK
美国Trek 诊断公司
仪器定位 单机容量 日均标本处理量
检测原理
检测技术 平均阳性报告时 间 药敏试剂
✓ 1882年由德国医生Koch发现。
✓ 结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌 纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝 杆菌属。
✓ 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、
非洲型和田鼠型，而人型结核分枝
杆菌是人类主要的致病菌。
8
2020/9/20
GDTB
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结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
生物学主要特点： 1. 细胞壁中含有大量 脂质 2.引起的疾病都呈慢性， 并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性
上部空间
已预先充填10% CO2
肉汤
改良Middlebrook 7H9肉汤
传感器
对氧气高度敏感的钌复合物
O2 O2
O2
O2
O2 CO2
FFO2F
F F
F
F F FO2 F
无或微弱荧光
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强荧光
MGIT /3D制造的液体培养基
优点
• 比固体培养快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天) • 比固体培养基更敏感 • 可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读 • 也加快了药敏试验的速度