常用食品用防腐剂对微生物防腐效果测定公共卫生学院预防医学专业2008级本科一班尹绘权
1 研究背景
食品腐败是影响食品安全的主要因素之一，进食污染微生物的食品而引起的食源性疾病已成为世界范围内的一个重要公共卫生问题。
保证食品的品质、延长保存期限、防止食品及原材料的腐败变质、避免损失是食品工业的重要任务。
一方面，目前为止尚未研制出对微生物侵染有抵抗力的食品品种，食品中微生物的污染仍将在今后相当长的一段时间内继续对人类健康造成威胁；另一方面，食品生产、加工、流通、制作方式的改变以及食品销售的异地化等对食品保质期的要求越来越高，因此食品的保鲜与防腐已成为食品加工生产面临的首要问题，而对食品防腐剂的选择和防腐效力的检测与评价已成为社会关注的热点。
2 实验目的
本次实验设计以测定食品中常用的食品防腐剂对不同微生物的防腐效果为目的，确定防腐剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。
菌落生长被完全抑制的最低防腐剂浓度为该样品对受试菌的MIC。
根据受试菌的MIC的大小来确定食物中常用防腐剂对该种微生物的防腐效果。
3 实验原理
食品含有丰富的蛋白质、碳水化合物和脂肪等营养物质，在物理、化学和有害微生物等因素的作用下可腐败变质，其中有害微生物是导致食品腐败变质的主要原因。
这些微生物包括：细菌，主要类群有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌等；酵母，如白色假丝酵母等；丝状真菌，主要类群有黑曲霉、黄曲霉、白地霉、岛青霉和圆弧青霉等。
在食品中常添加的防腐剂有；酸性防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸(及其盐)；酯型防腐剂，无机防腐剂等。
其应用范围和针对的微生物类群都不尽相同。
本实验以山梨酸为实验用模式防腐剂，以细菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌)、酵母(白色假丝酵母)、丝状真菌(黑曲霉、黄曲霉、白地霉、岛青霉和圆弧青霉)为模式微生物，为模式微生物进行试验。
山梨酸又名花揪酸，生活中常使用山梨酸钾作为防腐剂对食物进行防腐处理，其对细菌、真菌均抑制作用的机理大致是：在溶液中，弱酸随pH不同在解
离和未解离状态间存在动态平衡。
在低pH值情况下该类防腐剂有最大抑菌活性，因为此时分子多数处于未电离状态，未电离的有机弱酸分子是亲脂性的，因此可自由透过原生质膜，进入细胞内后，在细胞内接近中性的pH环境下，分子解离成带电质子和阴离子，不易透过膜而在细胞内蓄积。
防腐剂分子不断扩散进入细胞直到达到平衡，引起细胞内H +的失控，改变细胞内pH状态及蓄积毒性阴离子，抑制细胞的基础代谢反应，最终达到抑菌目的。
4 实验材料
4.1 菌株
本实验选择易导致食品腐败变质的致病细菌和真菌标准菌株，在此基础上，通过预测和既往资料，增加了对食品卫生质量影响较大、并易引起食品污染和食源性疾患的代表性微生物为实验用菌。
1.G+细菌金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus )
2.G-细菌大肠杆菌( Escherichia coli)、肠炎沙门菌( Salmonella enteritidis )
3.酵母白色假丝酵母/白色念珠菌( Candidalbicans)
4.丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(A. flavas)、白地霉( Geotrichum
candidum)、岛青霉( Penicillium islandicum)、圆弧青霉( P. cyclopium)
4.2培养基
营养琼脂培养基，马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(P otato Dextrose Agar，PDA) 4.3 试剂
1.灭菌生理盐水
2.防腐剂：选择食品加工业中最常用的山梨酸为模式防腐剂
4.4 实验器具
生物安全柜，微量移液枪，37摄氏度恒温箱，27摄氏度恒温箱等。
5试验方法
本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的防腐剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定防腐剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）。
菌落生长被完全抑制的最低防腐剂浓度为该样品对受试菌的MIC。
菌落生长被完全抑制的最低防腐剂浓度为该样品对受试菌的MIC。
5.1 防腐剂溶液的配制
以无菌操作取山梨酸钾10g，分别加入到90 ml 灭菌磷酸盐缓冲液中，充分振荡溶解，配制成10%均匀分散的溶液或悬浊液，并用灭菌磷酸盐缓冲液依次稀释成质量百分浓度为2%，1.5%，1.2%，1%，0.9%，0.8%，0.7%，0.6%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08% ，0.07% ，0.06% ，0.05% ，0.04% ，0.03% ，0.02% ，0.01% ，0.005%的稀释液（该浓度可以通过预先实验测得），置45～50 ℃水浴备用。
5.2 培养基的配制
分别配制单倍浓度和双倍浓度MH 琼脂培养基（细菌用）和SDA 培养基（真菌用）。
5.3 含防腐剂培养基的配制
分别取10 ml 5.1节中稀释的防腐剂溶液加入平皿内，将双倍浓度MH 琼脂10 ml 加入平皿内，边加边摇晃平板，使防腐剂溶液和培养基充分混匀；再分别取10 ml 5.1 节中稀释的防腐剂溶液加入平皿内，将双倍浓度SDA 培养基10 ml 加入平皿内，边加边摇晃平板，使防腐剂溶液和培养基充分混匀。
配制好的培养基中含防腐剂浓度分别为10.00、7.50、6.00、5.00、4.50 、4 .00、3.50 、3.00、2.50 、2.00、1.50、1.00 、0.50 、0.45、0.40、0.35 、0.30 、0.25 、0.20、0.15 、0.10、0.05、0.025 mg/m。
5.4 加样
用微量移液器取 2 μl（含菌量约为107cfu/ml）菌悬液点种于含防腐剂培养基的平板上，接种后所形成的菌液圈直径约5～8 mm。
以同样方法接种不含防腐剂的单倍浓度的MH琼脂平板和SDA 平板，作为阳性对照。
5.5 培养
将接种后的细菌平板放置37 ℃培养箱中，倒置培养24 h，观察结果；真菌平板放置28 ℃培养箱中，倒置培养48 h，观察结果。
6预期结果
列表比较各种微生物的MIC值的大小单位（mg/ml）
根据文献所查结果可知：山梨酸无论是对细菌还是真菌均有较强的抑制作用，而且山梨酸对细菌的抑制作用强于丝状真菌和酵母。
故细菌的MIC值应该小于酵母和丝状真菌。
7 结果讨论与分析
7.1 实验用菌种
在食品防腐剂防腐效果评价时微生物的选择至关重要，一般应包括革兰阴性细菌、革兰阳性细菌、霉菌和酵母中的至少一种。
本次试验分别选择了革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、丝状真菌和酵母中的代表性菌种为受试微生物，这一组合基本满足了防腐剂效果评价对微生物的综合要求。
其中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉和白色念珠菌，是食品中常见的腐败微生物，具有明显的实验意义。
此外还增加了从食品中分离、易导致食品腐败变质的其他细菌和真菌，从而使对防腐剂防腐效果的评价更接近现实。
7.2 受试微生物浓度的选择
每种防腐剂均有一定的抑菌范围，且其抑菌效果与食品中污染的微生物种类和污染程度密切相关。
食品染菌情况愈重，防腐效果就越差，如果食品已腐败变质，任何防腐剂都无济于事。
因此受试微生物的浓度是影响食品防腐剂防腐作用的重要因素。
经文献查知，大多数研究以细菌培养24h、真菌培养5～7天、酵母菌培养24～48h 的培养物稀释到10- 4(约相当于105cfu/ml)为实验用菌浓度。
这一稀释度有一定的科学性，但不够准确。
为此若需改进此点，较为合理的方法可以使用分光光度计测定细菌浓度后再进行试验。
7.3 实验用防腐剂及其浓度的选择
对于不同的食品，由于其基质成分、来源、属性、加工方式不同，因此污染的优势微生物类别各异。
各种食品防腐剂对不同类别微生物的抑制或杀灭能力差别较大，因此实际工作中对具体使用的食品防腐剂种类和浓度的选择应根据食品
属性、工艺条件、防腐剂性质、防腐剂间的相互作用等特点来确定。
本实验选用食品加工业中最常用的山梨酸为模式防腐剂，实验用浓度均在《食品添加剂使用卫生标准G B 276022007》中规定的各类食品使用范围内，从而使实验结果更接近实际，有利于对实验设计的合理性和正确性进行科学评估。
参考文献
1. 李凤琴，李玉伟，王晔茹，董银萍，罗雪云，王竹天，食品用防腐剂防腐
效果测定和评价程序研究，卫生研究杂志2009.11
2. 郑萍，陈西平,化妆品中污染微生物对常用防腐剂的抵抗性,环境与健康杂
志2009.8
3. 孟哲，刘荣琴，于玲,食品防腐剂及其作用机理的研究进展，形态学院学报
2009.6
4. 李妍，宁正祥，微生物对食品防腐剂的抗性研究进展，广州食品工业科技
杂志2004.7
5. 曾锋，张立彦，曾庆孝微生物对食品防腐剂的抗性研究进展及应对措施，
现代食品科技杂志2004.11
6. 国家标准化管理委员会. G B 276022007 食品添加剂使用卫生标准[ S] . 北
京:中国标准出版社, 2007.。