血小板功能检测及其临床应用【关键词】血小板; 功能检测; 临床应用血小板检测方法可归纳为出血、血栓和药物监测3大类。

虽则有些方法能应用于多种检测目的，但为特殊目的而创建的方法亦有重要价值。

故在检测时应合理地运用。

1 出血性疾病监测中的应用血小板的基本功能是黏附、聚集、分泌、促凝血、血块回缩。

通过这些功能维持着正常人体的初期止血作用。

由于这些功能异常而导致的出血疾病包括遗传性和获得性两类，在有些疾病同时会有血小板功能异常和数量减少。

1.1 遗传性血小板功能异常疾病①黏附受体蛋白异常：GPIb Ⅴ Ⅸ(BSS,血小板型vWD,Bolin Jamieson 综合征)、GPⅡb/Ⅲa(血小板无力症)、GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ。

②可溶性激动剂受体异常:TXA2受体,P2Y12受体、α2 肾上腺素能受体。

③血小板颗粒异常:δ 颗粒(δ 贮存池缺陷、Hermansky Pudlak综合征等)、α 颗粒(灰色血小板综合征，Quebec血小板病等)。

④信号传递途径异常:TXA2途径异常、Ca离子流动异常、Gαq缺陷、GSα高反应、PLC pleckstrin磷酰化缺陷。

⑤膜磷脂异常:Scott综合征、Stormorken综合征。

⑥其他异常:原发性释放异常、Montreal综合征、Ehlers Danlos综合征、May Hegglin综合征等1.2 遗传性血小板数量减少疾病①体积减小：Wiskott Aldrich综合征、性联血小板减少症。

②体积正常：家族性血小板病、先天性无巨核细胞性血小板减少症。

③体积增大：巨大血小板综合征、血小板型vWD、May Haegglin异常、灰色血小板综合征、Montreal血小板综合征。

1.3 获得性血小板功能异常这种异常十分常见，可由下列不同原因引起：①药物、食物和维生素;②慢性肾衰;③体外循环;④骨髓增生异常疾病;⑤抗血小板抗体等。

血小板功能缺陷检测的方法包括：①血细胞分析仪在测定血小板数量及外形大小中应用;②血小板功能:出血时间(血小板功能分析仪，(FPA 100R)、黏附性测定、聚集功能测定、释放功能测定(致密颗粒：5 HT、ADP、ATP、δ 颗粒缺陷 Hermansky Pudlak 综合征、Chediak Hygashi 综合征(荧光法)、α 颗粒：TF4、β TG(α 颗粒缺陷 灰色血小板综合征、Quebec 血小板病、Jacobsen或Paris Trousseau 综合征)(ELISA法，试剂盒),PF3有效性; Ca2+释放与内流,、血栓烷形成、cAMP、GAMP;血块回缩;③膜受体分析采用流式细胞术和电泳术(黏附受体GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb，激动剂受体P2Y12、GPⅥ);④基因分析采用分子生物技术;⑤其他(超微结构)。

上述检测方法目前巳成为疾病诊断的基本手段，但随着对疾病的病理机制的深入研究以及包括血小板信息传递在疾病中的新的认识，许多蛋白分析技术巳逐渐成为研究方法中的一部分，但它们的应用可能仅限于研究目的而言，而不适合一般医院的临床检测应用。

血小板体积测定不仅能反映血小板生成及衰老，而且在鉴别遗传性血小板疾病中也是一项十分有用的指标。

在巨大血小板综合征中的巨大血小板在末梢血涂片可达80%，其直径达到20 μm以上。

最新也有报道非巨大血小板综合征而血小板体积明显增大数量减少病因不清的遗传性巨大血小板减少症。

体内出血时间结合血小板数曾是血小板数量与质量异常所致出血的筛选试验，但由于出血时间存在种种不足而被弃之不用。

血小板黏附性所测得的结果是血小板聚集和黏附的总和，不能独立反映黏附功能也被弁之。

PFA 100TM是一种模拟体内初期止血的测定仪，又名“外出血时间”，结果以血小板闭塞网眼停止血液流动的“闭合时间”表示。

故可以检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的疾病，血栓性疾病、GPⅡb/Ⅲa拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、血管性血友病及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。

与出血时间试验相比，在诊断vWD中的敏感性>90%。

由于此项检测所需费用较高，限制了其广泛应用。

血小板聚集性测定是被应用最广泛、发展和改进最多的一项测定。

至今为止，巳发展而成的血小板聚集仪包括有比浊法、阻抗法(全血血小板聚集仪)、光散射法和Verify Now分析仪(Ultegra快速血小板功能分析仪)。

在测定血小板聚集的仪器中，设计有可以同步测定血小板腺核苷酸释放和血小板胞浆Ca2+浓度的装置，具有多功能性。

比浊法最常用，诱导剂通常为ADP、胶原、花生四烯酸和瑞斯托酶素等4种。

但存在标本分离、制备、诱导剂种类与浓度选择、正常值设定等影响因素，缺乏各实验室之间的可比性。

在一项误差分析中，其总体的SD为3.7%～7.7%。

所以，对一份聚集率为64.81%±7.7%,其分布范围49%～80%，从个体化角度进行判断分析时，其意义较为有限。

在遗传性血小板功能性疾病中,由于聚集反应显著下降，这类误差不影响临床诊断，是一项十分有用的指标。

其他各项试验譬如颗粒释放产物、花生四稀酸代谢产物，血小板膜磷酯酰丝氨酸、Ca2+、膜糖蛋白、基因分析等项目在诊断疾病中仍被继续广泛应用，是诊断血小板功能疾病所必需的基本检测项目。

但由于遗传性血小板疾病在临床上颇为少见，一般医院很难具有独立地全面检测这类疾病的能力，许多试验仍未能广泛应用展开。

2 血栓性疾病监测中的应用在血栓性疾病中存在着血小板的短暂或持续活化。

活化的血小板其形态、功能或蛋白的结构变化，这些变化构成了活化标志物检测的基础。

目前用于血栓性疾病检测的方法有:2.1 血小板聚集是至今为止在检测血栓性疾病中仍能应用的一项试验，但其灵敏度不高。

譬如比浊法，它既不能检出低于5个血小板组成的聚集反应，也不能检测循环血小板聚集体。

鉴于这些需求，随后出现了一些新的方法，譬如Wu & Hoak报道的全血血小板聚集体检测法,血小板对ADP/AA聚集反应阈值和自发性血小板聚集体测定法, 检测血小板聚集反应中所形成大小不同的聚集体激光衍射法，或采用血小板计数仪测定聚集后的标本中剩余的血小板数等。

PA 200型聚集仪(Kowa,Japan)是通过光散射及一系列复杂镜片组建成的激光衍射仪，能检出PRP中由2至3个血小板组成的聚集体。

用此项检查，发现在急性冠状动脉综合症中存在<100个血小板组成的聚集体，现已应用于急性冠状动脉综合征、脑卒中和TTP等血小板高反应性疾病中。

但在遗传性的黏性血小板综合征中，患者血小板对ADP和/或肾上腺素诱导的血小板聚集反应增高，采用比浊法血小板聚集仪即可予以诊断。

血小板聚集虽然存在不灵敏的反映血栓形成，但最近人们发现，通过计算方法的改进成为可预示经皮冠脉介入治疗后患者心肌损伤的标志物。

2007年Marcucci等在367例PCI 后发生急性心梗患者的心肌损伤测定中进行了此项研究。

此项方法命名为残留血小板反应性(residual platelet reactivity,RPR)检测法。

它以血小板聚集率和PFA 100中测得的闭合时间为基础，以超出对照组血小板聚集率第90%者值或低于PFA 100中闭合时间203s(CT/EPI )作为临界值，计算RPR。

采用此法检测时所测得的RPR值与反映心肌梗死的指标CK MB和cTnl基本一致(P<0.0001)，是当前以血小板功能检测来反映心肌梗死的较好的方法。

2.2 网织血小板测定此系2008年Cesari 等描述的一项能反映ACS的有用指标。

其原理是血小板中残存的mRNA用噻唑橙黄荧光染料标记，在Sysmex XE 2100 血液分析仪中测定。

观察网织血小板百分率%(IPF)和反映mRNA总量的荧光强度%(H IPF )。

在ACS组中IPF和H IPF明显升高，表明ACS中血小板周转加快。

2.3 活化标志物分可溶性与非可溶性两类。

2.3.1 可溶性血小板活化标记物β TG、PF4、TXB2、5 HT，P 选择素、Ca2+。

血小板颗粒内容物的释放产物PF4和β TG曾作为血小板储藏池疾病和血小板活化标志物，但由于在操作过程中常可引起血小板体外活化，故二项指标已逐渐为其他指标所替代。

过去几年采用过的前列腺素代谢产物TXB2,在作为反映血小板活化方面也因存在体外活化的问题，而11 去氢 TXB2是相对稳定的终末产物，其结果更可靠。

P 选择素存在于血小板和内皮细胞。

血小板表面的P 选择素是活化过程中α颗粒膜上的P 选择素与血小板表面膜整合产物，在静息血小板表面上很少，是血小板活化的较特异的标志物。

但活化血小板表面的P 选择素与血液中白细胞相互作用后很快丢失，因此，这项指标在反映活化程度中的灵敏度也有所降低。

可溶性P 选择素虽则在几年前也被视为血小板活化标志物，但1997年Fijnheer通过在ITP、TTP等的观察中，证明可溶性P 选择在正常人中的主要来源是血小板，但在许多疾病状态时是来源于内皮细胞，其特异性不如血小板P 选择素。

在作为血小板活化标志物的选择上应选用血小板表面P 选择素。

作为细胞信使的某些成份如cAMP、Ca2+等在血小板基础研究中予以应用，其中血小板胞浆Ca2+浓度的测定随着它与某些临床疾病之间关联的发现，现已在血脂增高和降血脂治疗，以及动脉粥样硬化患者中检测应用。

常用方法是采用Fura 2的荧光法，也可采用带有钙离子浓度测定的血小板聚集仪。

2.3.2 非可溶性血小板活化标记物CD 62p、CD 63、LAMP 1、CD40L、GPⅡb/Ⅲa、磷脂酰丝氨酸,微粒,白细胞 单核细胞聚集体,微小血小板聚集体。

血小板膜糖蛋白Ⅰb、Ⅱb/Ⅲa、Ⅴ、Ⅰa等是参与血小板黏附和聚集功能的主要黏附蛋白，在一些遗传性血小板疾病中明显下降，而在血栓性疾病中也可见到某些糖蛋白表达增高。

采用相应的单抗可检测这些膜糖蛋白在膜表面表达量及血小板活化时的分子构型改变，作为血小板活化标志物。

CD 40L位于α颗粒，血小板活化时表达在血小板表面，参与血小板间，或与白细胞间黏附和聚集，与P 选择素相似，是活化的重要标志物。

表达在血小板表面的CD 40L断裂后流入在血液中，则为可溶性CD 40L(sCD 40L)。

在血小板表面及血液中的CD 40L是目前临床应用的两个活化标志物。

新近报道的血小板活化标志物包括血小板促凝活性、微粒和单核细胞 血小板聚集体检测等3项指标，在一些文献中已有应用报道，其敏感性可能优于现用的金标准P 选择素。

血小板促凝活性采用能与磷酯酰丝氨酸结合的Annexin V作标志物，通过流式细胞仪测定与Annexin V 联结的FITC荧光强度，可获得血小板表面参与凝血反应的磷酯酰丝氨酸的量。

血小板微粒是血小板活化时从血小板囊孢脱落或伪足断裂而存在血液中的颗粒,直径为0.1～1 μg。