苹果的品质分析实验报告一、还原糖的测定-3，5-二硝基水杨酸法1.1【实验目的和要求】1、掌握还原糖定量测定基本原理2、学习比色定糖法的基本操作3、熟悉分光光度计的使用方法1.2【实验原理】还原糖是指含有游离的半缩醛（酮）基的糖。

单糖都是还原糖，某些双糖如乳糖、麦芽糖是还原糖；多糖则为非还原糖。

多糖在水溶液中不形成真溶液，只能形成胶体，于此可将之与可溶性的单糖和双糖分开。

在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸与还原糖公热后被还原成3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其产物。

在一定范围内，还原糖的量和反应中的棕红色物质颜色深浅的程度成正比例的关系。

在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求出还原糖的含量。

利用酸可使没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，这样可分别求知样品中总糖和还原糖的量。

该定糖法，操作简便，快速，杂质干扰少。

1.3【实验器材】分光光度计、水浴锅、电子分析天平、电炉、精密PH试纸、试管、三角瓶、容量瓶、量筒、玻璃漏斗及滤纸、移液管1.4【实验材料及试剂】（1）苹果（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：把6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol /L NaOH 溶液加到酒石酸钾钠的热溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中（3）500μg/ml 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的分析纯葡萄糖500mg,加少量水溶解后再加3ml 12mol/L 浓盐酸（防止微生物生长），加水定容至1000ml1.5【实验操作步骤】1、葡萄糖标准曲线的绘制取六只试管编号，分别按1顺序加入试剂，进行操作。

表1管号 1 2 3 4 5 6 500μg/ml葡萄糖0．0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5DNS试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加热沸水浴5min，然后冷却蒸馏水/ml 4 4 4 4 4 4 A540 00.0320.1020.1720.2510.304将上述各管溶液摇匀，在分光光度计上于波长540nm处比色测定，用空白（1号管）溶液调零点，记录吸光度值A540 nm。

以葡萄糖含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线于坐标纸上.2、样品中还原糖的提取准确称取3份实验材料约0.5g,于研钵中磨成匀浆（加水约3ml），转入三角瓶，并用水约30ml 冲洗研钵2-3 次，洗液一并转入三角瓶中。

于沸水上加热20nin，冷却后定容到约50ml容量瓶中，过滤后待测。

3、样品含糖量的测定拿6只试管编号，分别按表2顺序加入试剂，进行操作。

将各管摇匀后，用标准曲线的空白管溶液调零点，测定它们的吸光度，从标准曲线上查出其相应的含糖量。

表2管号11'22'33'还原糖待测样品/ml 0.5DNS试剂/ml 0.5加热沸水浴5min，然后冷却蒸馏水/ml 4mlA540nm 0 0.032 0.102 0.172 0.251 0.3041.6【结果计算】葡萄糖含量标准曲线如下：按下述公式计算出样品中还原糖的含量。

还原糖含量=还原糖质量（mg）×样品提取液体积（ml）/还原糖样品质量（mg）×0.5(ml)吸光度 1.67 1.698 1.781 1.781 1.916 1.962 还原糖质量/mg 1.313 1.336 1.4 1.4 1.505 1.541 还原糖含量26.26% 26.72% 28% 28% 30.10% 30.82% 平均含量28.32%1.7【结果分析与讨论】二、蛋白质含量的测定————考马斯亮蓝G-250染色法2.1【目的和要求】掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法.2.2【实验原理】考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。

该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

2.2【实验器材】分光光度计，离心机，分析天平，药物天平，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，刻度吸管，具塞刻度试管，漏斗，漏斗架，剪刀2.3【实验材料和试剂】（1）苹果（2）.标准溶液：准确称取100mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，即为1000μg/ml (3)染色液：称取0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇溶液中，再加入100ml 85% 磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml，此溶液可放置一个月2.4【实验步骤】1．标准曲线绘制0~1 000μg／mL 标准曲线的绘制：另取6 支10mL 具塞试管，按表1取样。

其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL 的标准曲线。

表1管号 1 2 3 4 5 6 100μg/ml牛血清蛋0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0白/ml蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0得到从1号到十号管牛血清蛋白溶液浓度分别为0，200,400,600,800,1000ug/ml,准确吸取各管溶液0.1ml，分别放入10ml具塞试管中，再加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后，在分光光度计上，于595nm波长处，以0号管做空白调零，测定吸光度A595nm，以蛋白质浓度为横坐标，A595um为纵坐标，绘制0~1000ug/ml标准曲线·2．样品提取液中蛋白质浓度的测定称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。

吸取提取液0.1mL （做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。

以标准曲线1 号试管做空白。

测得样品吸光度A595nm.2.5【结果计算】蛋白质标准曲线如下：由标准曲线可以查出相应的蛋白质浓度（μg/ml），可按如下公式计算出样品中蛋白含量样品蛋白质含量（μg/g鲜重）＝查出的蛋白提取液质量浓度（μg/ml）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））计算结果如下：管号 1 1' 2 2' 3 3' 吸光度0.232 0.155 0.152 0.201 0.178 0.183蛋白质浓度/μ415.7 305.7 301.4 371.4 338.6 345.7 g/ml样品蛋白质含量2078.5 1528.5 1507.1 1857.1 1692.8 1728.5 μg/g平均μg/g 1732.0832.6【结果分析与讨论】三、维生素C的测定----2，6—二氯酚靛酚滴定法3.1【目的和要求】掌握用2，6—二氯酚靛酚测定维生素Cde 原理和方法。

3.2【实验原理】维生素C（抗坏血酸）属于水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一，缺乏时易得坏血病。

它广泛存在于植物中，尤以蔬菜与水果中含量丰富。

维生素C有强的还原性，在中性和微酸性环境中它能将呈蓝色的染料2,6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或酸性溶液中呈蓝色。

所以，当用2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸全部被氧化后，再滴下2,6-二氯酚靛酚将立即使溶液呈淡红色，从而显示到达滴定终点。

如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。

此法操作简便，但存在下列缺点：①生物组织中的脱氧抗坏血酸及结合抗坏血酸同样具有维生素C的生理作用，用此法不能测出。

②生物材料提取液中含有的其他还原性物质，也可以使2,6-二氯酚靛酚还原脱色而引起误差。

③提取液中常存在的色素类物质干扰滴定终点的观察。

由于提取液中其他还原性物质还原2,6-二氯酚靛酚速度较慢，故可将滴定过程控制在2min之内，并判断终点以淡红色15～30s内不消失为准。

当提取液绿色素太多，严重干扰终点判断时，可先用白陶土或AL(OH)3乳液脱色。

这些措施在一定程度上减少了测量的误差。

3.3【实验材料】离心机，研钵，三角瓶（100mL×4），容量瓶（50mL×1），量筒（20mL×1），大离心管（50mL×1），滴定管（酸式）（×1），移液管（10mL×2）。

3.4【实验材料及试剂】⑴苹果⑵0.005mg/mL标准维生素C溶液：准确称取维生素C20mg，用1%草酸溶液定容至200mL。

以1%草酸稀释定容至200mL。

临用时配，冰箱中储存。

⑶0.1mg/mL2,6-二氯酚靛酚溶液：称取干燥的2,6-二氯酚靛酚钠20mg，放入200ml 容量瓶中，加热蒸馏水150ml，滴加0.01mg/mlNAOH溶液4~5滴，剧烈摇动10min，冷却后加水至刻度。

摇匀后用滤纸过滤，放入棕色瓶中。

储存在冰箱中备有，有效期1周，使用前标定。

⑷1%草酸溶液，2%草酸溶液。

3.5【实验步骤】1．样品提取取1g白菜叶，加5ml 2%草酸溶液，于研钵中研磨成浆状，将提取液及残液一起转移到离心管中，用20ml2%草酸溶液分2~3次冲洗研钵，溶液一并转入离心管中，在其中加入AL(OH)3乳液（可用适量白陶土代替），摇匀并静置约5MIN ，然后以3000r/min离心15~20min，上清液转移到50ml容量瓶中，以2%草酸溶液定容至刻度，即为样品提取液，摇匀备用。

2．标准液滴定准确吸取0.005mg/ml标准维生素c溶液10ml，放入三角瓶中，同时吸取10ml1%草酸溶液于另一个三角瓶中做空白对照，用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色出现，且15s内不消失为止，记录所用毫升数，计算每毫升2,6-二氯酚靛酚溶液所能氧化抗坏血酸的毫克数。