TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列 旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物 ( special prime, 简称sp1，sp2，sp3，约 20 bp), 用它们分别和1个具有低Tm 值的短 的(14 bp) 随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD) 相组合, 以基因 组DNA 作为模板, 根据引物的长短和特异性 的差异设计不对称的温度循环, 通过分级反应 来扩增特异引物

巢式PCR可以增加有限量靶序列（如 稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了 困难PCR的特异性。
另外，如果大片断扩增错误，则小片 断错误扩增的概率很大。
锚定PCR（Anchored PCR）
以基因组总DNA 为起始材料, 用于克隆某一已知 片段的侧翼序列, 如分离某一基因的调控序列, 分 析T-DNA 或转座子插入突变体等。
第一次循环时，外引物的融合温度只能比没 有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后， 由于GC- clamp已导入初级产物，因此以后 的融合温度可以提高。
由于采用了两种不同退火温度的引物，所以 巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序 中某个阶段一些引物工作，另一些引物 “休 闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工 作。
在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于 内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中， 早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与 模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此 扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由 于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是 被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。 因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外 引物5ˊ端增加多个GC钳子（GC- clamp）达到 扩增片断的目的。
锚定PCR 方法
主要由以下3 个步骤组成: (ⅰ) 以基因组总DNA 为 模板, 用一条基因特异性引物(GSP1)进行线性 PCR扩增, 产生单链扩增产物; (ⅱ) 在末端转移酶 的作用下, 在单链DNA 分子的3′末端加上多聚胞嘧 啶; (ⅲ) 用巢式基因特异性引物(GSP2)和与多聚胞 嘧啶配对的锚定引物(AAP)对加尾的产物进行PCR 扩增, PCR 产物连入载体后进行测序鉴定。
首先合成第一链DNA，然后再添加一同聚物尾（ polydC)，与同聚物尾配对的3′锚定引物（带有限制 性内切位点polydG)一起作PCR扩增
5′ 3′CC…CC
DNA
末端核酸转移酶
5′
CC…CC 锚定引物
3′CC…CC
5’
GG…GG
不对称PCR
用来序列的单链 DNA
热不对称交错PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR, 简称TAIL－
PCR)
是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA 序列 的分子生物学技术。该技术由Liu 和Whitter 首先 研究并报道。在分子生物学研究领域中，利用该技 术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图 谱绘制的探针，也可以直接测序。
TAIL－PCR 技术原理：
由一个特异性引物和一个简并引物组合构成 的PCR 反应叫做“半特异性PCR 。这种反 应会产生3 种不同类型的产物: (1) 由特异性 引物和简并引物扩增出的产物; (2) 由同一特 异性引物扩增出的产物; (3) 由同一简并引物 扩增出的产物。 在TAIL－PCR 反应中, 后两种非目标产物可 以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应 来消除。
此方法在分子生物学研究中应用广泛，可以用于 检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点kb以内的片段。 DNA的酶解程度、自连接效率以及引物在基因组 中的相对专一性是IPCR 成功的关键: (1) 如果 DNA酶切不完全，可能因片段过长而导致无法扩 增或扩增得到多个产物带。实验中使用过量限制 性内切酶、大酶切体积和长时间处理非常必要。
TAIL－PCR 一般分为3 次反应 ，第1 次PCR 反 应由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环 构成。通过5 次高特异性的反应，使sp1 与已知 的序列(载体或T-DNA等) 退火并延伸, 提高目标 序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结 合到较多的目标序列上，10 次较低特异性的反 应使两种引物均能与模板退火, 随后进行12 次 TAIL 循环(即高特异性和低特异性循环交替)。 经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物： 特异性产物(Ⅰ型) 和非特异性产物(Ⅱ型和Ⅲ型) 。
(2) 在酶解片段的自连接反应中，如果DNA 浓度过高或反应体积过小，则可能导致生成 串联多聚体。 (3) 普通IPCR反应使用的引物 一般长20 nt，退火温度相对较低，在以总基 因组DNA的酶解自连物为模板进行扩增时， 很可能发生非特异匹配，导致非目标产物的 生成。可以使用较长的两个特异引物 ( 25 nt～30 nt) ，退火温度高，可最大程度地减 少由引物非特异匹配引起的假阳性片段扩增。
PCR技术的发展和应用
多重PCR(multiplex PCR)
1.原理
在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物,针 对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多 个目的片段的PCR技术。这一概念由 Chamberian等于1988年提出。 优点：多重PCR同时扩增多个目的基因,可节省 时间、降低成本、提高效率,特别是节省珍贵 的实验样品。
巢式PCR （Nested PCR）
利用两对以上的引物扩增出不同长度片断的技术。 第一对引物：外部长片断扩增引物； 第二对引物：内部短片断扩增引物。 巢式PCR是为了从一个DNA模板的同一区域扩增 出不同长度片断即外部长片段和内部短片段而设 计的特殊方法，前者的引物称外长引物，后者的 引物称内部引物，特异地称为巢式引物，由它扩 增出的片段也称套组片段。两类产物（外长和套 组片段）的 Tm值是不同的，因此在外引物和套组 引物与各自靶位点融合的温度不同。