实验四 碱性磷酸酶米氏常数的测定
一．实验目的
1.通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。

2.学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。

二．实验原理
当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。

此时反应速度为最大速度（V max ）。

如图5-1所示。

Michaelis Menten 对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼（Michaelis-Menten ）方程式：
式中Km 即为米氏常数，Vmax 为最大反应速度，当v =Vmax/2时，则Km=[S]。

Km 是酶的特征常数，测定Km 是研究酶的一种方法。

由于用Michaeis-Menten 方程中的V 与[S]作图求Km ，不方便，Lineweaver-Burk 将上式变形，以1/v 对1/[S]作图，如图5-2：
Vm
1/2Vm
Km [S]
图5-1
图5-2
作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。

本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。

其反应式如下：
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其Km值。

三．预习题
试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。

四．实验器材与试剂
1．0.1 mol/L碳酸盐缓冲液（pH10）溶解无水碳酸钠6.36 g，碳酸氢钠3.36 g，于蒸馏水800 ml，将此溶液转入1000 ml容量瓶内，加蒸馏水至刻度，贮存于棕色瓶中。

2．0.04 mol/L基质液称取磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2·2H20）10.16 g或者磷酸苯
二钠（无水结晶）8.72 g，用煮沸冷却的蒸馏水溶解，加4 ml氯仿（防腐），并稀释至1000 ml。

盛于棕色瓶中，冰箱内保存。

此液只能用一周。

3.碱溶液取0.5mol/L氢氧化钠溶液和0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml，混合后加蒸馏水于100ml
4．0.5%铁氰化钾称取5 g铁氰化钾和15g硼酸，各溶于400 ml蒸馏水中，溶解后两液混合，再加蒸馏水至1000 ml,置于棕色瓶中，暗处保存。

5. 0.3%4-氨基安替比林 4-氨基安替比林0.3g及碳酸氢钠4.2g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml，至棕色容量瓶中，4°C保存
6．酚标准液用市售标准酚液用蒸馏水稀释成0.1 mg/ml。

7．0.9% NaCl。

五．实验操作
1.底物浓度对酶促反应的影响
（1）取6只试管按下表操作
（2）加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37°C水浴中准确保温15分钟。

（3）保温结束，立即加碱溶液1.1ml终止反应。

（4）各管分别加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml，0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管对照，在510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酶活性。

（5）以各管基质液浓度的倒数1/【S】为横坐标，以各管吸光度的倒数或者以酶活性单位的倒数1/v为纵坐标，作图求出Km值。

2.酚标准曲线的绘制
（1）去洁净干燥试管6支，按下表加入试剂
（3）以酚含量（×10－6g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。

六．结果计算
在37°C保温15分钟，每生成1mg酚为一个酶活性单位，以标准曲线查出释放酚量（×10－6g）即可算出酶活性。

100ml血清中酶活性=释放的酚量×（1/0.1）×100×（1/1000）
七．思考题
1．为什么说米氏常数K m是酶的一个特征常数而V m则不是？
注：酶活力单位定义：每100 ml酶量在37℃与基质作用15分钟，产生1 mg酚为1金氏单位。

2．以v的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[S]的倒数1/[S]为横坐标，在方格纸上描点并连接成线，求该酶的Km值。

八．注意事项
1.血清取量要准确。

2.标准曲线必须是过原点的一条直线。