过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法
二、实验原理
H 2O
2
被过氧化氢酶分解出H
2
O和O
2
，未分解的H
2
O
2
用KMnO
4
在酸性环境中滴
定，根据反应前后H
2O
2
的浓度差可求出反应速度。

2H
2O
2
= 2H
2
O + O
2
2KMnO
4 + 5H
2
O
2
+ 3H
2
SO
4
= 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 5O
2
↑ + 8H
2
O
本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。

在保持恒定的条件下，用相同浓度的过
氧化氢酶催化不同浓度的H
2O
2
分解。

在一定限度内，酶促反应速度与H
2
O
2
浓度
成正比。

用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。

三、实验器材
锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管
四、实验试剂
1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7)
2、0.004 mol/L KMnO
4
(需标定)
3、0.05 mol/L H
2O
2
(需标定) 4、25% H
2
SO
4
五、实验操作
1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。

2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
先加好0.05mol/L H
2O
2
及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起
始反应时间。

各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H
2SO
4
终止反应，充分混
匀。

用0.004 mol/L KMnO
4滴定各瓶中剩余的H
2
O
2
至微红色，记录消耗的KMnO
4
体积。

六、实验计算
分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v。

C 1V 1
10
[S] = 5 ∕2C2V2
C 1V
1
–
v =
式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L)
C 1：为H
2
O
2
物质的的量浓度(mol/L)
V
1：为H
2
O
2
的体积(mL)
10：反应的总体积
v：反应速度(mmol/min)
C 2: KMnO
4
物质的量浓度(mol/L)
V
2：KMnO
4
的体积(mL)
以1/v对1/[S]作图求出Km。

七、实验注意事项
( 1 ) 按表先加H
2O
2
及蒸馏水。

( 2 ) 准确控制各瓶中酶促反应时间尽量一致。

( 3 ) 各种试剂的加量应准确。