mL三角瓶、150mL三角瓶、吸管5mL， 10mL、量筒100mL、25mL碱式滴定管及滴定 台、蝴蝶夹、恒温水浴、滴管
• 试剂：
10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）、中性甲醛溶 液 、 0.25% 酚 酞 加 50% 乙 醇 溶 液 、 标 准 0.1M NaOH溶液、胰蛋白酶溶液
(一)V-S曲线
❖ 在低底物浓度时, 反应速度 与底物浓度成正比，为一 级反应。
V初 V max
❖ 底物浓度增大与速度的增 加不成正比,为混合级反应.
❖ 当底物浓度达到一定值， 几乎所有的酶都与底物结
合后，反应速度达到最大
值（V max），此时再增
加底物浓度，反应速度不 再增加，表现为零级反应。
底物浓度对酶促反应初速度的影响
实验步骤
1．取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚 酞（pH8-10），以0.1M标准NaOH滴定至 微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。
2．量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三 角瓶，37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也 在37℃保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到 酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即 取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含 甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以 0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在 接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加 一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的 0.1M标准NaOH mL数。
低
（二）米氏常数
实验原理
• 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方 程来表示：
Vmax [S] V= Km + [S]
• v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）； • Vmax──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；
• ［S］──底物浓度（mol/L）； • Km──米氏常数（mol/L）。
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白 为例，采用Linewaeaver―Burk 双倒数作图法测定Km值。胰蛋白 酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L精氨酸或者L-赖氨酸）的羧基所 形成的肽键水解。水解时有自由 氨基生成，可用甲醛滴定法判断 自由氨基增加的数量而跟踪反应， 求得初速度。
-1/Km
-4
0.8
0.6
1/v
实验六
底物浓度对酶促反应速度的影响 —米氏常数的测定
实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应的影响。
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响 酶反应速度的各种因素的科学。
影响酶反应速度的因素有： 底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。
2.掌握测定米氏常数Km的原理和方法。
实验原理
底物浓度对酶促反应速度的影响
实验步骤
3.在1分钟、2分钟、6分钟时，分别取出10mL 反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上 操作，记下耗去NaOH mL数。
以滴定度（即耗去的NaOH mL数）对时间 作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相 对于40g/L的酪蛋白浓度）。
4.然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋 白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、 V10。 利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出 Vmax与Km值。
0.4
0.2
1/Vmax
0.0
-2
0
2
4
6
1/[S](1/mmol.L-1)
8 10
曼尼希反应（Mannich反应）
❖ 曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物 （通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成β-氨 基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有机 物，具有较高的反应活性，可以和带有—OH（羟基）、— SH（巯基）、—NH2（氨基）基团的分子发生亲核加成反 应，最终甲醛作为亚甲基（—CH2—）的提供者，与上述基 团中的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来
思考题
1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.在什么条件下，测定酶的Km值可以作为
鉴定酶的一种手段，为什么？ 3.米氏方程中的Km值有何实际应用？
实验原理
• 这个方程表明当已知Km及Vmax时，酶反应速度与
底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度 达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同 的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也 不同。
• Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值 大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测 Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的 Km值在0.01～100mmol/L。
米氏常数的测定
基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的 直线方程，再用作图法求出Km。
例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式：
➢ 米氏常数Km的测定：
取米氏方程式的倒数形式：
斜率=Km/Vmax
1.0
1 Km 1 1
= +
V Vmax [S] Vmax
实验步骤
（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内 保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速 度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低， 产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反 应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。 因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确 的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误 差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进 行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的 加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时 间。
酶的Km在实际应用中的意义
❖ 鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来 源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同 反应的酶是否是属于同一种酶。
❖ 判断酶的最适底物（天然底物） 。 ❖ 计算一定速度下底物浓度。 ❖ 了解酶的底物在体内具有的浓度水平。 ❖ 判断反应方向或趋势。 ❖ 判断抑制类型。