29
七. 回收凝胶
关闭恒流泵， 旋松密封圈调 节螺帽，取出 下端柱头，回 收杯放在柱子 下端，打开恒 流泵，等待凝 胶流出。最后 将柱头凝胶洗 入回收杯。
30
分离效果例举
基线平稳，洗脱峰又高 又窄，分离效果好。
完全分离。但峰拖尾， 说明样品有扩散。
峰之间重叠，分离 失败
31
思考题



2
凝胶 颗粒
凝 胶颗 粒
大小分子在固定相中洗脱 行为与洗脱体积示意图
固 定 相
大分子：全排阻，不能进网 小分子： 全进入 , 中等分子 ：部分进入 , 孔从颗粒间隙流 洗脱体积 下, 洗脱体积Ve Vt 洗脱体积V0 分配系数 Kav = 洗脱体积 ml/min Ve Vt V0 V0
3
常用凝胶的种类及性质
下端柱头结构
密封圈调节螺帽 的作用： 旋松时密封圈 直径缩小，便于 取出；旋紧时密 封圈被压扁，直 径变大，防止柱 体漏液。
滤膜 密封圈 垫圈
密封圈调 节螺帽
17
二 . 层析柱的安装
洗净层析柱，垂直固定在柱架上:
18
层析柱的安装
旋松密封圈调节螺丝 取下柱头。检查滤膜 是否存在，将柱头装 进玻璃柱体内。
37
操 作 步 骤
将数据采集器通道1 （或通道2）的导线 按颜色分别接在紫 外检测仪背面“记 录仪”的接口上， 要接牢固。
打开电脑，双 击桌面的“N 2000 在线生化 工作站”，选 择通道，进入 工作站界面。
38
3.点击“数据采 集”，进入层析 图谱界面
1.点击“实验信 息”，输入相关 的信息
凝胶过滤层析脱盐
在进行离子交换层析纯化之前，样品要 求尽可能去除盐分子。
凝胶过滤层析简介
概念：以葡聚糖凝胶为固定相，以水溶液为流动相， 当水溶 性生物大分子通过层析柱时，根据它们分子大小不同而 进行分离的技术。
原理： 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构， 被分离的混合物流过层析柱时，比凝 胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内， 在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，洗 脱体积小，最先被洗脱出来；比网孔 小的分子能不同程度的自由出入凝胶 孔内外，在柱内经过的路程较长，洗 脱体积大，最后被洗脱出来。由此达 到分离。
经丙酮沉淀后干燥的CHOM溶解时需要 一点时间，耐心搅拌溶解。 样品液体积要严格控制在20毫升以下
25
五.
加样
1.MOV
加样前确认仪器管道连接、 流速设定、分析参数等是否正 确, 基线是否平稳，然后加样：
基线平稳
1. 关闭恒流泵，关紧止水夹，剪裁 一直径略小于柱子内径的圆形滤 纸片（要求对样品无吸附作用）， 放入柱内，让其自由下降紧贴在 凝胶床面。小心吸去多余的液体， 凝胶床面上留下薄薄的一层液体 即可。
12
液相层析系统的组成：
基本的液相层析由流路系统、层析分离系统、 检测系统、数据处理系统等部分组成。在本实验中： 1.流路系统： 恒流泵及输液管道 2.分离系统： 层析柱 3.检测系统： 紫外检测仪 4.数据采集处理系统： 数据采集器 N2000色谱工作站分析软件 5.输出系统： 电脑显示器及打印机
举例说明凝胶过滤层析主要应用于哪些方面。 凝胶过滤层析的哪些操作直接影响分离效果。 查资料计算：在5.0×60cm凝胶柱中脱盐时，就理论值而 言，最多加样体积是多少毫升？ 凝胶过滤分离大分子的机理是什么？能否用Sephadex G75柱分离分子量为8万和10万Da的蛋白质？为什么？ 在处理Sephadex时，能否剧烈搅拌，能否直接在电炉上加 热溶胀？用过的凝胶怎样保存？
0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液

11
操作步骤
液相层析系统的组成……13 层析柱的结构……………15 层析柱的安装…………..18 装柱………………………20 装柱效果举例…………..23 检测仪的准备…………..24 加样………………………26 层析检测过程示意图…..28 洗脱峰收集方法………..29 凝胶回收………………..30 分离效果例举…………..31 紫外检测仪的使用………32 N 2000 生化工作站使用…35
吸水量/(ml/g)
膨胀度 溶胀时间/h （床体积）/ （常温） (ml/g)
G-10
G-25 G-50 G-75 G-100
1.0±0.1
2.5±0.2 5.8±0.3 7.5±0.5 10.0±1
2 ～ 3
4 ～ 6 9 ～ 11
3
3 3
12 ～ 15
15 ～ 20
24
72
4
分级范围的含义举例
5cm 10cm
凝胶 沉降 面 缓慢 上升
20
装

柱
不断补充凝胶，维持液面在 ５cm标记线处。直到凝胶沉 降面上升到10cm标记线时， 停止加入凝胶,夹紧止水夹.

将柱子出水管道接入紫外检 测仪的进液管（接紧）。接 通恒流泵，设定流量为 1ml/min ,打开止水夹，在 此流速下用平衡液平衡柱子。 平衡时间大约2个柱体积(Vt)。
紧上 密紧 封柱 圈头 调螺 节帽 螺后 丝记 。住 旋
19
三. 装 柱
夹紧止水夹，往 柱内加入约1/3柱 体积的蒸馏水， 检查是否漏水。 打开止水夹，检 查出水是否通畅， 重新夹紧。 距柱顶端约10cm 及约５cm处画线 标记。柱口加一 小漏斗，灌入摇 匀的Sephadex G －25凝胶至５cm 标记线。 打开止水夹， 随着蒸馏水 的流出，柱 上液面下降， 柱底部凝胶 沉降面上升。
四. 检测仪器的准备

打开紫外检测仪，预热。按照“N 2000 生化工作 站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连 接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查 看”观察基线。
24
样品的准备：
用20ml 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液溶 解CHOM沉淀。若溶解后的溶液混浊，要 用滤纸滤去不溶物。收集滤液上 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐。
峰高
0
4
8
12
16
20
Байду номын сангаас
24
28
32
36
40
44
48
52
56
60
64
流速0.4
流速0.7
流速1.4
管数
9
洗脱峰收集方法：越靠近峰顶，收集液越纯。
10
试剂和器材

主要仪器
恒流泵(点击查看操作方法） 紫外检测仪 N2000生化工作站软件 电脑
Ø16×400mm 层析柱

材料
试剂
葡聚糖凝胶G-25（ SephadexG-25)
26
加 样 2. 用滴管将样品全部加入柱内 后，立即点击 “数据采集”。 3. 打开止水夹，样品流入柱床。 4. 待柱面样品剩下薄薄的一层 时，快速关紧止水夹。 5. 同上操作加入少量平衡液洗 下柱壁残留的样液。 6. 最后小心加入4-5厘米高度 的平衡液，上紧柱头螺帽， 启动恒流泵，开始层析。
27
返回上 级菜单
32
参考资料
赵永芳《生物化学技术原理与应用》
余冰宾《生物化学实验指导》 谢宁昌《生物化学实验多媒体教程》 以及网上免费下载的教学资料
33
紫外检测仪（核酸蛋白检测仪）使用：

面板功能键介绍

操作步骤
34
读数窗：显 示实时数值
选择280nm波长
电源开关 A调零： 基线微调 灵敏度旋 钮 工作灯
8
洗脱流速：凝胶过滤层析的分离效果对洗脱流 速很敏感。流速快，分离效果不好。但流速太 慢，也会因为样品扩散加剧而影响分离效果。 一般用1.0ml/min。适当的流速最好视具体情况 而定。
流速与分离效果、分析周期关系 柱床：1：10cm 加样体积：0.5ml
40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
型号 分离范围 /Da
（球蛋白）
分子量
（球蛋白）
排阻程度/Kav
洗脱体积
洗脱顺序
G-25
1000 ～ 5000
>5000
1000 ～ 5000 <1000
完全排阻 Kav=0
部分进入 0<Kav<1 完全进入 Kav=1
V0
Ve Vt Vt=V0+Ve
最快出峰
随后出峰 最后出峰
5
凝胶过滤层析的应用
光量旋钮 在灵敏度旋钮置 T100%位置且有平衡 液流过时操作：逆 时针方向关闭，读 数窗显示0，顺时针 打开，直至读数窗 显示100 ，调好后 层析过程不得再变 动。
35
操作步骤

接通紫外检测仪电源，工作灯亮。选择波长。仪器 “灵 敏度”旋钮选择“100%T”，预热1小时以上。 将层析柱下端出水管连接检测仪的进样管道，让层析 平衡液流通。用一烧杯接着仪器出水管口。 调节“光量”旋钮，使读数窗数值显示“100”。此后， 光量旋钮不再变动。 调节“灵敏度”旋钮到0.5A位置(是具体情况选择）。 调节“A调零”旋钮，使读数窗数值显示“0”。 观察数值是否稳定，如果稳定则可开始上样。 使用完毕，直接把恒流泵的输液管接到仪器进样口， 输入蒸馏水冲洗比色池1分钟，再输入空气排尽比色池 内的水，关闭电源，在仪器使用记录本上记录使用情 况。
六. 层析检测过程示意图
样品
N2000 生化工作站 (数据采集)
计算机
（Ｎ2000分析软件）
层
光信号转为电 信号
数据处理 图谱输出
析
柱
组分 组分的分 离洗脱
紫外 检测仪
洗脱组分的 紫外吸收检测
组分流出
收集器 收集洗脱峰
28