第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
本章小结：
（6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养； 悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇 与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。 （8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种 细胞法；双荧光标记选择法 （9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察； DNA内切图谱分析；同工酶分析
第三节、原生质体融合
一、原生质体融合意义
—克服杂交不亲合 —克服生殖器官败育 —克服柑桔多胚
第三节、原生质体融合
二、融合方法
无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术
第三节、原生质体融合
(一)无机盐诱导融合: NaNO3法
1972年： Carlson诱导原生质体融合获得 首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞 杂种。
第三节、原生质体融合
（四）PEG结合高钙-高pH诱导法
最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质 体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加 高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生 质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体 细胞团---筛选---再生杂合细胞
第三节、原生质体融合
(五)电融合技术
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第二节 原生质体培养
一、培养基
pH 渗透压
碳源 培养基
钙镁
氮源 生长物质
第二节、原生质体培养
二、培养方法
培养方法 液体浅层培养 平板培养法 双层培养法 饲养层培养法
第二节、原生质体培养
1、液体浅层培养
原生质体 悬浮液
2x105/ml
1mm厚液体培养基
第二节、原生质体培养
2、平板培养
原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼 脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7% ， 培养于培养皿中。
第二节、原生质体培养
3、双层培养法（固、液培养）
培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固 体培养基，在其上进行原生质体浅层培 养。
第二节、原生质体培养
4、饲养层培养
方法一：X-射线杀死原生质体，与生活 力正常的原生质体混合，加入0.7%琼 脂，制成混合液，培养于培养皿中。
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
第二节、原生质体培养
4、饲养层培养
方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7% 琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲 养层，再将生活力正常的原生质体与 0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。、原生质体融合
定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交， 使分离出来的不同亲本的原生质体，在人 工控制条件下，相互融合成一体，形成杂 种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。
第三节、原生质体融合
（三）PEG法
PEG法特点：
融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
第三节、原生质体融合
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物，在 原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原 生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉， 导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧 密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负 性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相 连而导致融合。
Senda 1979年首先用此方法实现原生 质体融合
第三节、原生质体融合
三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定
1．互补选择法 2、机械分离杂种细胞法 3. 双荧光标记选择法
第三节、原生质体融合
3. 双荧光标记选择法
异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色
第三节、原生质体融合
四、体细胞杂种植株的鉴定
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。
第三节、原生质体融合
（二）高pH-高Ca离子法
1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时，诱发烟草叶肉原 生质体融合。
优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
形态学鉴定 细胞学观察 DNA内切图谱分析 同工酶分析
第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交
本章小结：
(1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘 体细胞融合，进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面 法。 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。