• 原生质体纯化方法有： 离心沉淀法 漂浮法 接口法
1、 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。
步骤： • 第一步：原生质体溶液用400目网筛过滤。 • 第二步：离心（500~1000r/min离心5~6min）。 • 第三步：吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）
重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。 • 第四步：用原生质体培养液洗1次，收集原生
对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维 素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少
对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4 - 5.8
PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2.3 酶液渗透压
• 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下， 才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。 因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁 对原生质体起保护作用。
•常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。
目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地 维持渗透浓度。而蔗糖等易被原生质体吸收利用， 降低渗透浓度，故不常用。
2.4 材料预处理 (暗处理，预培 养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓 度的稳压液中，预质壁分离约一小时后再用 酶液处理。
2-6 其它
酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类
保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力
2-7 原生质体分离过程：一步法 （以烟草叶片为例）
• 第一步：预处理即对烟草植株限制供水
• 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥 去外表皮切成4cm的小块
• 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6
质体。
洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，
10mmol/LCaCl2 ` H2O, 0.7mmolK H2PO4,
洗涤液pH： 5.6
2 、 接口法
•原理：选两种不同渗透浓度的 溶液，其中一种溶液的密度大于 原生质体的密度，另一露醇溶液
细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。 因为细胞壁不仅具有保护功能，还参
与细胞的生长和分化等生命活动。
但是：原生质体必须再生出细胞壁才能
继续发育。
二、原生质体分离及培养
（一） 分离方法 1. 机械法：利刃机械切割 2. 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
2.Enzymatic isolation
2.1 材料 •获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的 植物体幼嫩部分。
1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；
2、原生质体培养的意义
（1）为细胞融合奠定基础。
有性杂交不能进行细胞质交流
（2）是遗传工程的理想受体。
能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。 原生质体也具有全能性
原生质体是分子水平和细胞水平上研 究遗传信息动态的结合点
（3）理论研究
•叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显 的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉 原生质体往往不能分裂，因此，常采用悬浮细 胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是 处于对数生长早期的细胞。
2.2 酶的种类和浓度
纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase）
高尔基体
液泡
微丝
叶绿体 线粒体
质膜
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
一、原生质体培养发展简史及其意义
1、发展简史
1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；
1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授 率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度 活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；
• 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10 小时
• 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液 含0.1 m mol CaCl2 ）。如此2~3次、得原生质体
图示原生质体分离过程（以叶片为例）
加果胶酶 和纤维素酶 过滤、离心
（二） 原生质体纯化
• 酶解处理后得到混合液包括原生质体、 细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶 液除去，才可以继续培养。
1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；
1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分 离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。
1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首 次获得再生植株。
1993年有49个科、146个属的320多种植物， 经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主 要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多 年生，从草本到木本、从高等植物到低等植 物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水 稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃 薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等；
原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增 加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度； 降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来 酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在 的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活 率。
2-5 酶解处理的条件
光：一般黑暗下静止进行； 温度：25℃，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原 生质体的活性，一般<24小时。如烟草叶片 酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。
25%蔗糖溶液
3、 漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使 原生质体漂浮在液体的表面。
洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl2 2 H2O 。或11%~23%的 蔗糖溶液。
4.原生质体培养与融合
原生质体培养的意义 原生质体操作方法 原生质体融合的意义 融合方法 体细胞杂种鉴定方法
原生质体（Protoplast）
• 1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开 的那部分细胞物质。
• 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的 裸露细胞。
细胞
植物细胞模式图