浅谈高效液相色谱的应用与发展Peishan Zou摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法。

本文旨在从仪器原理、仪器结构、应用范围、检测效率、检测准确度等方面简要介绍液相色谱分析法，及在不同领域的应用情况和本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。

着重对高效液相色谱的发展现状进行总结，并根据发展趋势而延伸，预测未来液相色谱仪的技术发展路线。

关键词：高效液相色谱；应用；发展现状；发展趋势1. 高效液相色谱的发展历史简况色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。

高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。

高效液相色谱法是目前各种色谱模式中应用最广的一个领域，在化合物的分析方面，世界上约有80% 的化合物，如括高分子化合物、离子型化合物、热不稳定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(如正相 HPLC、反相 HPLC、离子交换色谱和离子色谱、体积排除色谱、亲合色谱等等)进行分离分析[1]。

站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。

首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。

由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。

2.高效液相色谱仪的原理与构造2.1 高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。

制备型仪器还需配有馏份收集系统。

为了取得较好的分析结果，HPLC 仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求[2]。

（1）高压输液系统高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。

其中，高压输液泵是高效液相色谱仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa。

输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度[1]。

因此，输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和分析结果的可靠性。

（2）进样系统进样能在试样引入色谱柱，有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

图1 六阀手动进样器示意图（3）色谱分离系统色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。

常用的填料为硅胶，可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。

其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

（4）检测系统检测系统用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。

要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。

近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。

根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、红外检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱检测器(MSD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)。

（5）数据处理系统高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据。

图2 高效液相色谱仪的构造示意图2.2 高效液相色谱仪的工作原理储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来[4]。

3.高效液相色谱仪的应用3.1 高效液相色谱仪在食品安全领域的应用3.1.2 食品添加剂的检测食品添加剂主要常用的有三类：分别是防腐剂、甜味剂和色素。

添加剂的检测方法多种多样，例如气象法，比色法等，但是液相色谱法的优势非常明显，故现代检测技术中，多偏向于使用液相色谱法来检测。

在防腐剂检测方面，骆和东等[5]用Hypersil ODS色谱柱，流动相为0.02mol/L pH5.0乙酸铵甲醇溶液，柱温35℃，在不同波长下同时测定苯甲酸和山梨酸。

在合成色素的检测方面，吴敏[6]等采用Zorbax 80A Extend—C8色谱柱，高效液相色谱仪配备紫外检测器，同时测定食品中对位红和苏丹红等8种脂溶性燃料。

近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、苋菜红、亮蓝这十种食品常用添加剂。

其效率之高非其他仪器分析方法可比。

3.1.2 食品中危害物质的检测食品中有害物质主要可分为：农药、兽药残留；霉菌毒素；重金属；加工过程中高温或其它特殊条件下形成的致癌物质等。

黄曲霉毒素普遍存在于多种谷物类食品当中，具有极强的致畸致癌作用，王君[7]等用HyPersil ODS—C18色谱柱，测定食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量，该方法方便快捷，定性准确，较传统的点板法，酶联免疫吸附法更为科学准确。

高效液相色谱法在应对2008年奶粉掺入三聚氰胺风波的检测中发挥了重要作用，面对全国众多乳制品企业的样品进行检测，尽快出具检测结果给老百姓一个公正准确的结果，检测方法必须既要快，又要准，检出量还非常微小，能做到完美完成这一任务的，仅有高效液相色谱法能够做到。

目前检测三聚氰胺的方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法、气相色谱质谱联用法、液相色谱质谱联用法。

其中液相色谱质谱联用法由于能够快速地对三聚氰胺定性与定量，已成为大家首选的检测方法。

3.2 高效液相色谱仪在工业上的应用以往，在石油化工、农药、环保等方面，经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性的研究。

自七十年代以来，我国就有数家科研部门以及工厂前后研制并生产了液相色谱仪。

LC 开始在我国许多科学领域进入了实用阶段，尤其是对那些热稳定性差或蒸气压低的样品组分的分析，更显示了LC的优越性[8]。

近几年来，HPLC在油品分析，尤其是在石油中多环芳烃、重质烃的测定方面取得了突破性的进展。

苟爱仙等[9]以正己烷、二氯甲烷为流动相，用多维高效液相色谱技术及适宜的梯度淋洗条件，实现了渣油各烃族良好的分离和检测。

吕振波等[10]同样用HPLC对润滑油基础油的化学族组成进行了分离分析，以键合氰基柱和硅胶柱双柱切换的方式，正己烷为流动相，示差折光检测器检测，得到了不同产地和馏程的基础油烃类的族组成。

3.3 高效液相色谱仪在生命科学领域的应用生命科学研究工作中，最大的难题就是基因的解密工作，从基因组DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等。

这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组学（Proteome）研究中找到答案。

在所研究的细胞中会有3~5万种功能各异的蛋白质，目前蛋白质组研究所使用的双向电泳法一般只能分辨到2000~3000个蛋白质点。

现代蛋白质组的分析可尝试使用第一向是体积排阻色谱的双向HPLC高效液相色谱作预分离。

高效液相色谱和双向电泳将会成为蛋白质组学的重要分离工具。

因此，高效液相色谱仪将为深入地揭示生命奥秘作出更大的贡献。

4.高效液相色谱在当今时代的发展4.1 超高液相色谱 (UPLC)4.1.1 超高液相色谱(UPLC)的概述基于1.7μm小颗粒技术的超高液相色谱(UPLC)，与人们熟知的高效液相色谱(HPLC)技术，具有相同的分离原理。

不同的是，与HPLC相比，UPLC具有以下特征：(1) 更高的分离度UPLC TM用1.7μm颗粒提高了分离能力，可以分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了一个新的水平。

图3a UPLC TM与HPLC分离度的比较[11]ACQUITY UPLC TM系统：1.7μm颗粒提供的柱效比4.8μm颗粒提高了2.5倍。

1.7μm颗粒的分离度比5 μm颗粒提高了70％。

(2)更高的分离速度高通量实验室始终要求在单位时间内提供更多的信息和处理更多的样品并保证提供高质量的数据，UPLC色谱柱中较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。

结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史（图3b）。

图3b UPLC TM与HPLC分离速度的比较由于ACQUITY UPLC TM系统用1.7μm颗粒，柱长可以比用5 μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变，而且使分离在高3倍的流速下进行，结果使分离过程快了9倍而分离度保持不变。

(3)更高的灵敏度过去提高灵敏度的工作集中在检测器上，包括光学、质谱检测器。

然而采用超高效色谱系统更能获得灵敏度的显著提高。

图3c UPLC TM与HPLC分离灵敏度的比较UPLC TM的峰高显著显著比HPLC的要高，且波峰尖锐陡峭、波宽更狭窄。

另外，使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。

4.1.2 超高液相色谱(UPLC)的改进方向虽然分离原理相同，但ULPC并非普通HPLC系统改进而成。

它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（图4a），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器（图4b）、快速检测器及优化的系统体积、并解决超高压下的耐压及渗漏问题等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。

另外，由于分离速度的加快，还要求有高速检测器、系统控制及数据管理（图4c），解决高速数据的采集、仪器的控制问题。

这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。

图4a UPLC的小颗粒填充料[12]UPLC色谱柱中的硅胶基质乙基桥能耐高压，具有宽pH范围(pH1-12)和极高的柱效(1.7μm)，且有比硅胶低的硅醇基活性（较稳定）。

图4b 针内针装置（上样探头和吸样）[12]外针刺破密封，内针插入样品容器底部吸取样品可达到微量取样（µL取样），事实上消除了在穿透样品瓶盖时瓶盖碎屑及硬物使进样针弯曲，减少死体积，降低谱带扩展，低扩散、低交叉污染，实现快速进样。