弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物， 如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲 醇、乙酸乙酯/乙腈等
2. 流动相的选择原则是：
极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用弱 极性的流动相。
3. 混合流动相：
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种 不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配 比k值范围很广则使用梯度洗脱
2. C18有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类 型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化 学分析工作中应用最为广泛。
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按键合到载体上的官能团可分为：
1. 非极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分 子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用 的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱、C8、C4等
仪器分析第10讲
高效液相色谱分析2
朱永法 清华大学化学系
2005.5.10
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主要内容
• 高效液相色谱分离原理 • 液液分配色谱 • 离子色谱原理； • 凝胶色谱原理
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峰展宽因素
• 柱前峰展宽 是指由进样及进样器到色谱柱连接管引起 的峰展宽。
• 柱后峰展宽 主要由检测器流通池体积以及连接管所引 起的展宽。
• 液相色谱的柱外效应比气相色谱严重和显 著；
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液相色谱分离模式
一、吸附色谱（adsorption chromatography） 原理：
基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各 组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保 留和实现分离的方法。
固定相：
固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙 烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液 固吸附色谱。活性硅胶最常用。
正相色谱
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺 序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80 ％的顺、反 和邻位、对位异构体仍然要用正相 色谱来进行分离
• 在正相色谱柱中，极性弱的先流出
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反相色谱
1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：
• 液固吸附色谱法中最常用的吸附剂是硅胶，流动 相是以烷烃为基的二元或多元溶剂系统；
• 适合分离相对分子量中等的油溶性样品，对具有 不同官能团的化合物和异构体具有较高的选择 性；
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三、空间排斥色谱 （又称凝胶色谱和分子筛色谱）
2. 极性键合固定相： 键合在载体表面的功能分子 是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团 的有机分子
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液液分配色谱类型
• 正相色谱法HPLC（normal phase HPLC）：
流动相极性小于固定相极性的称为正相色谱，极性小的组分先流出，极 性大的组分后流出； 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代 表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附 色谱也属正相HPLC，适合于分离极性化合物
H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”， 通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相
2. 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极 性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定 相结合，所以先被洗脱下来
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液固吸附色谱法
• 流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据吸附 作用的不同而进行分离的色谱方法称为液固吸附 色谱法；
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应用
1. 吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍 是最有效的方法，如农药异构体分离、石 油中烷、烯、芳烃的分离。
2. 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象
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二、液液分配色谱
• 原理 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度 不同（分配作用）而在两相中进行不同分配实现 分离的液相色谱分离模式
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OH OH + C18H37SiCl3 OH
O O Si C18H37 O
1. 最常用的“万能柱” ——“C18柱”，简称“ODS” 柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料 （Octadecylsilyl，简称ODS）。在反相色谱中 发挥着极为重要的作用，可完成高效液相色谱 70～80％的分析任务。
• 反相HPLC（reversed phase HPLC）：
当流动相的极性大于固定相的极性的称为反相色谱，极性大的先流出， 极性小的后流出； 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系 正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的 流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，适合于分离 非极性或中等极性物质如：芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物
• 和GC的差异 相同的是：分离的顺序均取决于分配系数，分配 系数大的组分保留值大；不同之处是流动相的性 质对GC的分配系数影响不大，但对LC的影响很 大。
一般分为：液液色谱、键合相（bonded-phase）色谱
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液液分配色谱
1. 液-液分配色谱固定相：是通过物理吸附 的方法将固定液涂在载体表面，由于流动 相的溶解作用或机械力作用，固定相容易 流失，导致保留行为的改变，重现性很 差，引起分离试样的污染；
2. 键合固定相：以化学键合的方法将功能分 子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去；
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键合固定相
最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化 学键合相硅胶 ，优点是：
①硅胶的强度大； ②微粒硅胶的孔结构和表面积易人为控制 ③化学稳定性好
最常用的键合相键型是：硅烷化键合相，它 是硅胶与有机硅烷反应的产物 ；
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液液分配色谱流动相的选择原则
①样品易溶，且溶解度尽可能大 ②化学性质稳定，不损坏柱子 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收 ④粘度低，流动性好 ⑤易于从其中回收样品 ⑥无毒或低毒，易于操作 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯 ⑧废液易处理，不污染环境
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