作者单位:100730卫生部北京医院检验科(陈东科、张秀珍);新疆医科大学附属中医院检验科(朱玲)·论著·卡他莫拉菌快速鉴定的方法学及耐药性研究陈东科 朱玲 张秀珍 【摘要】 目的 建立快速鉴定卡他莫拉菌(MC)的方法,对不同血源、营养配方的琼脂培养基进行了MC的生长指数(GI)的测定,了解MC的耐药状况。
方法 使用含50μg/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基分离MC,以3-乙酰吲哚纸片法检测MC产生的乙酰酯酶,与DNA酶试验为对照;将MC 接种于9种培养基上,计算和比较MC在9种培养基上的平均GI;同时用Nitrocefin纸片检测MC的β内酰胺酶发生率,以琼脂平皿二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。
结果 检测228株MC的乙酰酯酶结果,其敏感性为100%,与203株近缘菌比较特异性为100%,与DNA酶试验有很高的相关性;MC 在巧克力琼脂培养基上生长较血琼脂培养基好,但与GI值比较,差异无明显意义(P>0.05);MC产β内酰胺酶的阳性率为93.0%;哌拉西林/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的MIC50和MIC90分别较单哌拉西林,降低了8倍;氨苄西林/舒巴坦的MIC50和MIC90较单氨苄西林降低了32倍和4倍。
结论 用3-乙酰吲哚纸片法检测MC产生的乙酰酯酶,是临床实验室快速鉴定MC的良好方法。
MC产β内酰胺酶阳性率之高,应引起临床医生的重视。
哌拉西林/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及亚胺培南/西司他丁对β内酰胺酶阳性MC有很好的抗菌活性。
【关键词】 莫拉氏菌属; 吲哚类; β内酰胺酶类; 抗药性,微生物A novel m ethod for rapid identification and drug resistance of Moraxella catarrhalis CHEN D ong-ke＊, ZH U Ling,ZH ANG Xiu-zhen.＊Depar tment of Laborato ry M edicine,Beijing Hos pital,Beijing100730,China 【A bstract】 Objective To establish a novel method for rapid identification and drug resistance of Moraxella catarrhalis,Different sourses of blood and the formula of chocklate agars were detected the Growth Index (GI).Metho ds Moraxella catarrhalis from specimens contaminated b y microbial flora were isolated with a choclate agar with50mg/L vancomycin(CHOC-V)method.Nine media were inoculated,on which GI were calculated and compared.beta-Lactamase were determined by nitrocefin slip method.Results 228strains of Moraxella catarrhalis and203strains of recent li mbus bacteria were examined.The sensitivity of this method was 100%,and the specificity was100%.The GI of Moraxella catarrhalis on chocklate agars and blood agars was higher than that of the BCA,NUA,MHA(P<0.05).beta-Lactamase positive rate in Moraxella catarrhalis was 93.0%.The MIC50and MIC90of PIPC/SBT and PIPC/TAZ against Moraxella catarrhalis were8times lower then PIPC.The MIC50and MIC90of AMP/SBT against Moraxella catarrhalis were8times lower then AMP.Co nclusions This method is rapid,accurate and simple for identifying Mo raxella catar rhalis.PIPC/SBT,CFP/SB T,PIPC/TAZ, AMP/SB T,IPM/CST showed high activity against Mo raxella catarrhalis of beta-Lactamase positive.【Key words】 Moraxella; Indoles; Beta-Lactamase; Drug res istance,microbial 卡他莫拉菌(moraxella catarrhalis,MC)为革兰阴性双球菌,原属奈瑟菌属(Neisseria catarrhalis,NC), Catlin在1970年将此菌分类为布兰汉菌属(Branhamella catarrhalis,BC),1984年在伯杰分类细菌学手册中被列为莫拉菌属的布兰汉亚属(subgenus branha mella)。
MC是人类上呼吸道的常居菌种,为条件致病菌。
该菌可引起人类的多种感染,可累及全身[1]。
国外资料显示,MC在成人下呼吸道感染及儿童肺炎、中耳炎等标本中的分离率,仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌列第三位[2,3]。
因此,快速鉴定MC具有重要的临床意义。
我们用3-乙酰吲哚纸片法检测乙酰酯酶,快速鉴定MC。
并测定4种β内酰胺抗生素的复方制剂及亚胺培南/西司他丁对β内酰胺酶阳性MC的抗菌活性。
报告如下。
材料和方法一、材料1.菌株来源:MC(228株)、淋病奈瑟菌(15株)、脑膜炎奈瑟菌(3株)、奈瑟菌属(153株)、莫拉菌亚属(24株)、博德特菌属(6株)、不动杆菌属(138株)均为临床分离株。
标准菌株MC9602,9707,0101为全国临床检验中心质控菌株,MC的ATCC25238、解乳糖奈瑟菌ATCC23970、淡黄色奈瑟菌ATCC 14799、脑膜炎奈瑟菌ATCC13102、金黄色葡萄球菌ATCC25923,29213为本实验室菌库保存。
2.培养基:5%羊血琼脂培养基(SB A),5%兔血巧克力琼脂培养基(RChoc),5%羊血巧克力琼脂培养基(SChoc),含50μg/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基(Choc-V),淋病奈瑟菌培养基(NGA),MH 培养基(MHA),5%羊血MH培养基(MHB),脑心琼脂培养基(B CA),营养琼脂培养基(NUA),中国蓝琼脂培养基(ZLA),DNA琼脂培养基均为本室自制。
3.试剂:蛋白胨、DNA琼脂粉、MH琼脂粉、VITEK-(NHI和GNI)鉴定试卡购自生物梅里埃公司。
万古霉素为美国礼来公司产品,盐酸四甲基对苯二胺、3-乙酰吲哚购自SI GMA公司,Nitrocefin购自OXOID公司(英国)。
氧化酶纸片(1%盐酸四甲基对苯二胺溶液浸泡纸片后吹干备用),乙酰酯酶纸片(100mg/ml3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50片纸片后吹干备用)[4],Nitrocefin纸片(12.5μg/片Nitr ocefin 吹干备用)。
4.抗生素:哌拉西林(PIPC),齐鲁制药厂产品;氨苄西林(AMP),华北制药有限公司产品;哌拉西林/舒巴坦(PIPC/SB T)(4∶1),海口杰威药物研究所有限公司产品;哌拉西林/他唑巴坦(PIPC/TAZ)(8:1),美国立达公司产品;氨苄西林/舒巴坦(AMP/SB T) (2∶1),头孢哌酮/舒巴坦(CFP/SBT)(1∶1),美国辉瑞公司产品;亚胺培南/西司他丁(IPM/CST)(1∶1),美国默沙东药厂产品。
二、方法1.菌株分离与鉴定:将可疑标本接种于SB A和Choc-V琼脂平板上,置5%C O2孵箱,35℃培养24～72h观察结果。
细菌的分离培养和鉴定按文献[5]进行,分离到的菌株经涂片革兰染色镜检、触酶、氧化酶试验后,用VITE K-(NHI和GNI)鉴定试卡鉴定到种。
2.氧化酶试验:按文献[5]进行。
3.DNA酶试验:按文献[5]进行。
4.乙酰酯酶试验:用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿,取待检菌落涂在纸片上,3min内出现蓝绿色为阳性反应。
以MC的ATC C25238,全国临床检验中心质控菌株9602,9707,0101作为阳性对照。
5.生长指数(GI)测定:取经Rchoc平板24h培养的卡他莫拉菌ATCC25238菌落于2ml无菌盐水中,制成0.5麦氏单位菌悬液,再用无菌盐水进行1: 10连续稀释,取10-5、10-6、10-7稀释度菌液100μl 分别接种在9种培养基上(Rchoc、Schoc、Choc-V、SB A、M HA、MHB、BC A、NUA、ZLA),分别置普通孵箱和5%CO2孵箱各1套,于35℃孵育24、48、72、96h,计数少于10个菌落平板上的菌落数,并用游标卡尺量出菌落直径,求其均值(mm),再乘以此最高稀释度的对数即得GI[6]。
6.β内酰胺酶试验:用无菌蒸馏水将Nitrocefin 纸片沾湿,取MC菌落涂在纸片上,5min内纸片变红色者判为β内酰胺酶阳性。
7.药敏试验:根据美国临床实验室标准化委员会1998年版标准,采用琼脂平皿二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),用多点接种仪定量种菌。
以金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌株监测整个试验过程,质控值超出范围者,该批试验数据作废,找出原因后重复试验。
结果1.氧化酶试验:228株MC、15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌氧化酶均为阳性,138株不动杆菌氧化酶为阴性。
2.DNA酶试验:228株MC中DNA酶全为阳性,15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌、138株不动杆菌中DNA酶均为阴性。
卡他莫拉菌对DNA酶的敏感性为100%,特异性为100%。
3.乙酰酯酶试验:15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、153株奈瑟菌、24株莫拉菌亚属、6株博德特菌乙酰酯酶均为阴性,138株不动杆菌中乙酰酯酶阳性114株(占82.6%),228株卡他莫拉菌乙酰酯酶全为阳性。