(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910189789.2
(22)申请日 2019.03.13
(71)申请人 湖北朗德医疗科技有限公司
地址 443000 湖北省宜昌市西陵经济开发
区西湖路产业孵化中心5号楼2层
(72)发明人 朱世新 朱玉华 石康
(74)专利代理机构 宜昌市三峡专利事务所
42103
代理人 成钢
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/6844(2018.01)
(54)发明名称
一种检测人类疱疹病毒-6（HHV-6）的RCA方
法
(57)摘要
本发明公开了一种检测人类疱疹病毒-6
（HHV -6）
的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）标本DNA的提取；（2）捕获探针的杂交，（3）锁式探针的
环化连接与酶切，（4）RCA扩增，再用琼脂糖凝胶
电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。
本发明锁
式探针结合RCA技术是一种检测人类疱疹病毒-6
（HHV -6）的新方法，通过锁式探针特异识别靶基
因序列，RCA扩增放大检测信号。
该方法不需特殊
设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检
测方面具有独特优势。
权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图1页CN 109825645 A 2019.05.31
C N 109825645
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109825645 A
1.一种检测人类疱疹病毒-6(HHV-6)的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：
(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得含人类疱疹病毒-6 (HHV-6)的基因组DNA样品；
(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含人类疱疹病毒-6(HHV-6)的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交，杂交完成后自然冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液的链霉亲和素包被的磁珠，混匀，室温放置，磁性分离，用1×结合缓冲液清洗磁珠数次，弃去洗液，得到杂交产物；
(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer，轻轻混匀，在95±1℃下反应3-5min，然后再在45±1℃下孵育后，加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶，混匀，在37±1℃进行环化连接反应；反应完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，混匀，在37±1℃反应，反应完成后在95±1℃下条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，得到探针环化连接产物；
(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、加入引物和10×phi29 Buffer，混匀后在95±1℃下反应3-5min，然后进行冰浴；再加入phi29 DNA聚合酶、dNTPs液，混匀后在37±1℃进行RCA反应，得到扩增产物；
(5)取步骤(4)制得的扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳，有肉眼可见条带扩增出来的为人类疱疹病毒-6(HHV-6)阳性，反之为人类疱疹病毒-6(HHV-6)阴性，即可完成对人类疱疹病毒-6(HHV-6)的检测；
所述步骤(4)中所设计用于RCA反应的引物是：
5’-ACCAGATCGACCACCTTATCGTTATCATAGAG-3’ SEQ NO1；
所述步骤(2)中的锁式探针为：
5’-CACCAAGAGTCTAGATAAACTAGATAAAAGCGGGAAGACCAACTACACGAATTCTGCTAACTTGCGATA CTAGTTAGCGACCGAATTCATTAGGTTTCAGTTTCAGACAACCACAGACACCGTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2；
所述步骤(2)中的捕获探针为：
Biotin-ACCAGATCGACCACCTTAAGTACCACGCACAAGCCTAAGTACCCTAGASEQ NO3。
2.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-6(HHV-6)的RCA方法，其特征在于，步骤(2)中锁式探针、捕获探针的浓度均为0.5-1.5μmol/L，且锁式探针、捕获探针相对于DNA样品体积的10-20％。
3.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-6(HHV-6)的RCA方法，其特征在于，步骤(3)中10×E.coli Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；10×BSA缓冲液相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；E.coli DNA连接酶相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的1.5-2.5％；10×Exonuclease I Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；Exonuclease I相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％。
4.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-6(HHV-6)的RCA方法，其特征在于，步骤(4)中引物的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％；10×phi29 Buffer的添加量为探针环化连接产物的9.5-15％；phi29 DNA聚合酶的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％。
2。