二次回归正交旋转组合设计优化复合酶法提取甘蔗梢多酚工艺张思原;黄慧玲;周永升;李玉铭;陆海勤【摘要】[目的]利用二次回归正交旋转组合设计优化复合酶法提取甘蔗梢多酚工艺条件,为甘蔗梢的综合利用提供技术参考.[方法]以粤糖159号蔗梢为试验原料,在单因素试验基础上,以甘蔗梢多酚提取量为考察指标,选择复合酶用量、pH、提取温度、提取时间为试验因素,采用4因子二次回归旋转组合设计(1/2实施)对甘蔗梢多酚提取工艺进行优化,确定复合酶法最佳工艺条件.[结果]建立甘蔗梢多酚提取量(Y)对复合酶用量(X1)、pH(X2)、提取温度(X3)及提取时间(X4)4个试验因素的二次正交回归模型:Y=4.51155+0.16908X0.20925X3-0.14736X32,该模型拟合性较好,其中复合酶用量和提取温度对甘蔗梢多酚提取量有极显著影响(P＜0.01).复合酶法提取甘蔗梢多酚的最佳工艺条件为:在复合酶(果胶酶∶纤维素酶=2∶3)用量1.6％、pH 5.0、提取温度56℃的条件下提取30 min,甘蔗梢多酚提取量的模型预测值为4.86 mg/g,重复3次试验的验证值为4.71 mg/g;通过检验分析,显著性水平为0.01时,验证值与预测值一致.[结论]采用二次回归正交旋转组合设计优化得到的复合酶法提取工艺条件准确可靠,有效提高了甘蔗梢多酚提取效率,可在实际生产中推广应用.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2016(047)003【总页数】7页(P459-465)【关键词】多酚;甘蔗梢;复合酶法;正交旋转组合设计;工艺优化【作者】张思原;黄慧玲;周永升;李玉铭;陆海勤【作者单位】广西大学轻工与食品工程学院,南宁530004;广西大学轻工与食品工程学院,南宁530004;广西大学轻工与食品工程学院,南宁530004;广西大学轻工与食品工程学院,南宁530004;广西大学轻工与食品工程学院,南宁530004【正文语种】中文【中图分类】R284.2【研究意义】甘蔗梢又名甘蔗尾叶，包括甘蔗顶的最嫩节及青绿叶片，约占甘蔗产量的20%，是甘蔗生产过程的主要副产物之一。
广西是我国甘蔗生产第一大省，年产量约7000万t，甘蔗梢可达1000万t以上，目前主要用于动物饲料或焚烧（张艳兰，2008；孙健等，2013）。
甘蔗梢富含多酚类化合物，约占整条甘蔗的37%，而蔗叶占33%，去梢后的蔗茎占30%（de Souza-Sartori et al.，2013）。
植物多酚有多种生物活性，在医药方面可利用多酚的抗氧化、抗病毒等活性制备疫苗，或作为延缓衰老及抗病毒等药物（扶雄等，2003；金莹和孙爱东，2005）。
因此，研究甘蔗梢多酚的提取工艺，对其合理开发与利用具有重要意义。
【前人研究进展】目前，关于甘蔗梢中有效成分的提取工艺研究已有不少文献报道。
孙晓雪（2007）采用乙醇溶剂浸提法提取甘蔗梢多酚，通过正交试验确定最佳提取工艺为：乙醇体积分数60%、固液比1∶4（g/mL）、提取温度60℃、提取时间2 h，甘蔗梢多酚提取量为185 mg/100 g。
苏杏严等（2011）利用微波辅助提取甘蔗梢中黄酮类多酚化合物，确定最佳提取条件为：乙醇体积分数60%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度60℃、提取时间50 min，在此条件下的提取率为0.255%。
李新莹等（2014）采用响应面法对超声波辅助提取甘蔗梢中抗氧化活性成分的工艺进行优化，最佳提取工艺为：在乙醇体积分数63.79%、料液比1∶14.34（g/mL）、25℃条件下超声提取3次，每次1.43 h，提取率为2.86mg/g。
何雪梅等（2015）采用响应面法优化超声波提取甘蔗梢多酚工艺，确定最佳提取条件为：在乙醇体积分数51%、超声功率720 W、70℃下提取90 min，甘蔗梢多酚提取量为4.649 mg/g。
【本研究切入点】生物酶法具有反应条件温和、提取时间短、耗能低等优点，近年来已广泛应用于植物多酚物质的提取（付晓燕等，2012；程雅芳等，2012；龚玉雷，2013），但目前尚无利用此法提取甘蔗梢多酚的研究报道。
【拟解决的关键问题】以甘蔗梢为试验原料、甘蔗梢多酚提取量为考察指标，通过单因素试验和二次回归正交旋转组合设计，对复合酶法提取甘蔗梢多酚的工艺条件进行优化，确定最佳提取工艺条件，为甘蔗梢的综合利用提供技术参考。
1.1 试验材料供试材料为粤糖159号蔗梢，采自广西南宁市吴圩区蔗田，干燥后粉碎过80目筛，冷藏备用。
果胶酶（≥50.0 U/g）、纤维素酶（≥15000.0 U/g）购自国药集团化学试剂有限公司，福林酚试剂购自北京雅安达生物技术有限公司，没食子酸标准品（>98%）、无水乙醇、无水碳酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等均为分析纯。
主要仪器设备有：722N紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、SHZ-82A水浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、SHB-III T循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、FW135粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、电子分析天平［梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司］。
1.2 标准曲线绘制准确称取0.05 g没食子酸标准品，加入去离子水完全溶解，定容于500 mL容量瓶，配制成0.1 mg/mL没食子酸溶液；准确吸取没食子酸溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL分别置于100 mL容量瓶中，配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8 mg/L不同质量浓度的没食子酸标准溶液；然后分别加入2.0 mL福林酚试剂、3.0 mL 10%碳酸钠溶液，充分混匀，用蒸馏水定容至100 mL，27℃下反应30 min，于769 nm处测定其吸光值。
以没食子酸质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线（图1），得到标准曲线方程：y=0.0978x+ 0.0228，R2=0.9946。
1.3 甘蔗梢多酚提取量计算吸取2.0 mL甘蔗梢提取液置于100 mL容量瓶中，加入2.0 mL福林酚试剂和3.0 mL 10%碳酸钠溶液，充分混匀，用蒸馏水定容至100 mL，27℃下反应30 min，于769 nm处测定吸光值，按标准曲线回归方程计算对应的甘蔗梢多酚质量浓度，再根据下式计算多酚提取量：多酚提取量（mg/g）=C×V×K/W×10-3式中，C为根据标准曲线计算得出的甘蔗梢多酚质量浓度（mg/L），V为提取液体积（mL），K为稀释倍数，W为甘蔗梢质量（g）。
1.4 单因素试验1.4.1 酶种类对甘蔗梢多酚提取量的影响准确称取5.0 g甘蔗梢粉末5份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再分别加入酶总用量为1.0%（以酶/底物质量×100计，下同）的5种酶解体系［果胶酶（种类1）；纤维素酶（种类2）；果胶酶与纤维素酶合成复合酶（种类3）；果胶酶、纤维素酶及木瓜蛋白酶合成复合酶（种类4）；木瓜蛋白酶（种类5）］，50℃下反应50 min后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.4.2 果胶酶与纤维素酶质量比对甘蔗梢多酚提取量的影响准确称取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再分别加入果胶酶与纤维素酶质量比为2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3的1.0%复合酶，50℃下反应50 min后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.4.3 复合酶用量对甘蔗梢多酚提取量的影响准确称取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20加入pH 5.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再分别加入0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3），50℃下反应50 min后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.4.4 pH对甘蔗梢多酚提取量的影响分别准确称取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分别加入pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再加入1.0%复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3），50℃下反应50 min 后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.4.5 提取温度对甘蔗梢多酚提取量的影响准确称取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分别加入pH 5.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再加入1.0%复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3），分别于30、40、50、60、70、80℃下反应50 min后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.4.6 提取时间对甘蔗梢多酚提取量的影响准确称取5.0 g甘蔗梢粉末6份，按料液比1∶20分别加入pH 5.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，再加入1.0%复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3），50℃下分别反应10、20、30、40、50、60 min后，85℃水浴灭酶，然后真空抽滤、收集滤液、定容，计算甘蔗梢多酚提取量。
1.5 二次回归正交旋转组合设计优化试验在单因素试验基础上，以甘蔗梢多酚提取量为考察指标，以复合酶用量、pH、提取温度、提取时间为试验因素，采用4因子二次回归正交旋转组合设计（1/2实施）对甘蔗梢多酚提取工艺进行优化。
试验因素与水平见表1。
1.6 统计分析采用Origin 7.0软件对单因素试验数据进行分析，再利用DPS 7.05软件对正交试验结果进行统计分析。
2.1 单因素试验结果2.1.1 酶种类对甘蔗梢多酚提取量的影响如图2所示，5种酶解体系得到的甘蔗梢多酚提取量差异明显，复合酶的多酚提取量高于单一酶。
以种类3（果胶酶与纤维素酶结合）的甘蔗梢多酚提取量最高（4.27 mg/g），其次为种类4，即果胶酶、纤维素酶及木瓜蛋白酶结合，甘蔗梢多酚提取量为3.75 mg/g。
种类4的甘蔗梢多酚提取量低于种类3，说明木瓜蛋白酶的存在会抑制果胶酶与纤维素酶的作用，因此，选择果胶酶与纤维素酶混合的复合酶提取甘蔗梢多酚。
2.1.2 果胶酶与纤维素酶质量比对甘蔗梢多酚提取量的影响由图3可知，复合酶中果胶酶与纤维素酶质量比不同，甘蔗梢多酚提取量有明显差异。
随着复合酶中纤维素酶含量的不断增多，甘蔗梢多酚提取量逐渐提高，因为细胞壁中纤维素含量较高，提高纤维素酶量能使细胞壁破裂更彻底，从而促使多酚溶出；当果胶酶与纤维素酶质量比为2∶3时，两种酶发挥最大活性，甘蔗梢多酚提取量达最大值（3.71 mg/g），质量比小于2∶3时，多酚提取量反而降低，说明复合酶对底物浓度已达到饱和，复合酶的作用受到抑制。