实验一抗体的制备及效价检测
实验目的：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。

了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。

一．实验原理
机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。

一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。

当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。

抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。

完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。

通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。

抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。

分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。

抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。

二．实验步骤
1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。

免疫作好标号。

分笼饲养。

2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。

3．佐剂和抗原乳剂的制备
佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。

抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。

（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。

（3）油剂和水剂1：1混合。

混合方式：研磨或者注射器混合。

4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。

第1次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。

A组2只（1-2号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。

B组4只（3-6号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。

第2次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。

A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。

B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。

第3次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。

A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。

B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。

5．抗血清的制备
第3次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。

收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。

在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。

6．抗体的效价检测：双向免疫扩散法。

琼脂凝胶板的制备：胶布包围一片载玻片使之形成不透水的槽，或在培养皿中。

用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶液，均匀浇注于玻片内。

注意勿产生气泡，琼脂厚度约2.5mm 。

打孔：待琼脂凝固后，用去尖头的吸头（直径约为3-4mm ）在凝胶上打孔，孔间距为3-5mm 。

在小孔中加少量加热的液体琼脂，防止渗漏。

打孔样式为梅花样，如图
加样：加样于孔内，左中间孔为抗原；右中间孔为无关抗原（牛血清白蛋白）；边孔为不同浓度的抗体（系列用生理盐水稀释的抗体1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32）。

注意不要外溢（加满为止）。

结果观察：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37 扩散18-24小时后，观察结果。

三．实验结果
四．结果讨论。