微生物的生理生化反应
第I部分
生理生化测定准备
大分子物质的水解试验
淀粉水解试验
固体淀粉培养基： • 蛋白胨 • NaCl • 牛肉膏 • 可溶性淀粉 • 蒸馏水 • 121 ℃灭菌20 min
10 g 5g 5g 3g 1000 ml
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明胶水解试验
明胶培养基：
• 牛肉膏蛋白胨液orLB液 100 ml（70℃）
• 明胶
12～18g
• pH
7.2～7.4
• 在70 ℃水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。
• 121 ℃灭菌30 min
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明胶培养基
▪ LB液体培养基
配制量：8 ml×3×组数×120%
分装：8 ml/15 cm试管 （直立柱）
▪ 注意：明胶含量12~18%。明胶培养基的配方是100 ml，明胶的含量一 般比琼脂高10倍；明胶熔点为25℃
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第II部分
微生物的生理生化反应测定 （8项）
依据
▪ 在所有活细胞中存在的反应称为代谢。代谢过程主要是酶促 反应过程。
▪ 多数酶在细胞内起催化作用，称为胞内酶。许多细菌产生胞 外酶，催化细胞外的化学反应。
▪ 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异，如表现在对大 分子糖类、蛋白质的分解能力，以及分解代谢的最终产物的 不同，反映出它们具有不同的酶系，这样就可以用生理生化 反应作为细菌鉴定和分类的内容。
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器材
▪ 菌种：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，分离细 菌。
▪ 培养基：固体淀粉培养基，明胶培养基。 ▪ 试剂：卢戈氏碘液 ▪ 仪器：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。
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淀粉分解试验
淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域就不产生蓝色，表明 细菌产生淀粉酶。
枯
大
草
肠
芽
杆
孢
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器材
▪ 菌种：大肠杆菌，普通变形杆菌，分离细菌。 ▪ 培养基 ：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各4支。 ▪ 仪器： 试管架，接种环等。
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葡萄糖发酵试验
有些细菌能分解某种糖类产生有机酸和气体，有些只产酸不产气
（
产 酸
变
少形
不杆
产 气
菌
）
（
大 肠
产 酸 产
杆气
菌）
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乳糖发酵试验
▪ 有些细菌能分解某种糖类产生有机酸和气体，有些只产酸不产气
▪ 明胶的融化：称量好的明胶先用冷水浸泡，然后加入到加热至70℃左
右的LB液体培养基中搅拌融化。
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糖发酵试验
葡萄糖发酵培养基及乳糖发酵培养基：
• 蛋白胨水培养基
1000 ml
• 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
1～2 ml
• 糖（葡萄糖、乳糖）
10g
• pH
7.6
115 ℃灭菌30 min
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勿使 小管 内有 气泡， 以免 混淆 试验 结果
柠檬酸盐培养基：
NH4H2PO4
1g
K2HPO4
1g
NaCl
5g
MgSO4 柠檬酸钠
0.2 g 2g
蒸馏水
1000 ml
1％溴香草酚蓝乙醇溶液
10 ml
• 将上述各成分加热溶解后，调pH 6.8，然后加入指示剂，摇匀。制成 后为黄绿色，分装试管，121 ℃灭菌20 min。注意配制时控制好pH， 不要过碱，以黄绿色为准
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糖发酵基本原理
▪ 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为 重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖 类的能力上却有很大差异。
▪ 有些细菌能分解某种糖类产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体 （如氢气、甲烷、二氧化碳等）；有些只产酸不产气。
▪ 发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不 同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色。气体的 产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
不（ 变 产不 形 气产 杆 ）酸 菌
大 肠
产（ 气产
杆 ）酸
菌
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实验结果
葡萄糖发酵试验
乳糖发酵试验
对 变 大 不能倒置试剂 对 变 大
照形 肠
照形 肠
杆杆
杆杆
菌菌
菌菌
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IMVIC的意义：
▪ I: 吲哚试验（indol test） ▪ M: 甲基红试验(methyl red test)（M.R.试验） ▪ V: V.P试验(Voges-Prokauer test)（伏－普） ▪ C: 柠檬酸试验(citrate test)（枸橼酸盐利用试验） ▪ i无实际意义，是为了好读加上去的
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IMViC试蛋白胨水培养基：
• 蛋白胨 • NaCl • 蒸馏水 • pH • 121 ℃灭菌20 min
10 g 5g 1000 ml 7.6
葡萄糖蛋白胨水培养基：
• 蛋白胨 • 葡萄糖 • K2HPO4 • 蒸馏水 • pH • 115 ℃灭菌30 min
5g 5g 2g 1000 ml 7.0~7.2
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作用
▪ 这4个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的 细菌检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中如超过一定数量，则 表示水质受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查 水时，要将两者分开
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IMVIC实验：
吲哚试 甲基红 V.P试验 柠檬酸
验
试验
试验
+ + 大肠
杆菌
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微生物生理生化反应8项
▪ 一、大分子分解：明胶分解、淀粉分解2项； ▪ 二、糖发酵实验：葡萄糖、乳糖2项； ▪ 三、 IMVIC实验4项；
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大分子分解基本原理
▪ 微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须 靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。
▪ 胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合 物，使其能被运输至细胞内。这些作用过程可通过观察细菌 菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细 菌水解淀粉的区域就不产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
菌
杆
ห้องสมุดไป่ตู้
菌
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明胶液化试验
▪ 明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状 态，以固体形式存在。有些微生物可产生凝胶酶胞外酶，而使明胶液 化。
枯
草
大
芽
肠
孢
杆
杆
菌
菌
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明胶液化试验
为增加对比，图中的试管中加入了甲基红，将被液化的明胶染成微红色。
E.coli B. subtilis S. aureus
-
-
产气 肠杆菌
-
-
++
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器材
▪ 菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌，分离细菌。 ▪ 培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培
养基。 ▪ 试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％ α-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。
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1.吲哚试验