微生物的生理生化反应
姓名：王雪学号：201500140130 班级：2015级四班2组同组者：张彬、田文娅
一、实验目的
1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不通过的酶系统。
2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。
二、实验原理
微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。
代谢过程主要是酶促反应过程。
许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。
各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。
大分子水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。
脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。
糖发酵试验：是常用的鉴别微生物的生化反应。
某些细菌能利用糖类作为碳源和能源，使糖类分解为产酸产气或产酸不产气。
不同种的细菌对于各种糖类利用能力不同，分解产物也不同。
大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。
当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。
气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
吲哚实验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
但并非所有的微生
物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
甲基红实验：用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。
大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。
因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
三、实验器材
1、菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌（大分子水解试验）
大肠杆菌、普通变形杆菌（糖发酵试验）大肠杆菌、产气肠杆菌（吲哚试验）
大肠杆菌、产气肠杆菌（甲基红试验）
2、培养基：
（1）固体淀粉培养基，固体油脂培养基（大分子水解试验）
（2）葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）
（3）蛋白胨水培养基（吲哚试验）
（4）葡萄糖蛋白胨水培养基
3、溶液和试剂：卢戈氏碘液，乙醚，吲哚试剂，甲基红试剂，蒸馏水，中性红试剂等
4、仪器或其他用具：培养皿，试管，酒精灯，烧杯，德汉氏小管，接种环等
四、实验步骤
A．大分子水解试验
1．淀粉水解试验
（1）配制固体淀粉培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在平板底部划成四部分
（3）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种，在平板的反面对应部分分别写上菌名
（4）将平板倒置，在37℃温箱中培养24小时
（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。
透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2.油脂水解实验
（1）配制固体油脂培养基，灭菌，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，分别在四部分表上菌名
（3）用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和产气肠杆菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心
（4）将平板倒置，在37℃温箱中培养24小时（5）取出平板，观察菌苔颜色
如果出现红斑点，说明脂肪水解，为阳性反应
B．糖发酵实验
3、葡萄糖发酵
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。
另取乳糖发酵培养基3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。
（3）将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养24~48小时
（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡
4.乳糖发酵实验
（1）培养基的配制：按照糖发酵培养基配置乳糖发酵培养基，分装至试管中，用胶头滴管往德汉氏小
管中注满培养基，再把德汉氏小管倒置放入试管中，注意不要让德汉氏小管中进入空气，每组五只试管，灭菌。
（2）接种：待培养基冷却至常温时，在无菌操作台上，取乳糖发酵培养基试管2支接入大肠杆菌，再
取两只接入普通变形杆菌，接种后轻摇试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡第五支不接种，作为对照。
在各试管外壁上贴上标签，标签上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（3）培养：把接种后的试管放在试管架上，把试管连同试管架放入培养箱中于28℃下培养两天。
（4）观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡，并记录实验结果。
C．吲哚实验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支蛋白胨水培养基，置37℃培养48h
（2）在培养48h后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管避徐徐加入2滴吲哚试剂。
在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
D．甲基红试验
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入3支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37℃培养48h （2）培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。
五、实验结果
1．淀粉水解实验.
（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
2.油脂水解实验
因为培养基的制作未按照课本上的要求，所以培养基可能制作失败，导致四种菌全部没有结果。
1.糖发酵实验葡萄糖培养基（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
乳糖培养基（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
2.吲哚实验（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
3.甲基红实验（以“+”代表阳性，“-”代表阴性）
结果分析：理论上产气肠杆菌在培养早期产生有机酸，但一段时间后，产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，从而出现阴性。
但实验结果显示为阳性，分析可能是培养时间不够长，或者接种时出现失误，把菌株弄错了。
另外可能是甲基红滴加太多，出现假阳性。
六、思考题
1、你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
淀粉是大分子,不能通过细胞膜进入细胞,所以细胞中产生的淀粉酶,只能分泌到细胞外去发挥作用,而且菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解所以淀粉酶肯定就是胞外酶2、不利用碘液怎么证明淀粉酶存在？
如果不用碘液鉴定淀粉的存在,可以使用斐林试剂来鉴定是否生成了还原性糖,麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,淀粉则是非还原性糖
3.假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵实验会出现什么结果？
耗氧气、产生二氧化碳及其他废气、产生水分
由于产生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。
德汉氏小管中有气柱。
4.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么这个实验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性指示剂，而不用丙酮酸？
色氨酸是植物体内生长素生物合成重要的前体物质,其结构与IAA（吲哚乙酸,即生长素）相似,在高等植物中普遍存在.某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。