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微生物生理生化反应

微生物生理生化反应
实验原理
通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。

某些细菌产生色氨酸酶,能分解培养基蛋白胨中的色氨酸,产生吲哚,当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂,形成红色的玫瑰红吲哚,为吲哚反应阳性。

V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。

微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸,2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸,继续脱羧形成乙酰甲基甲醇,后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应,形成红色化合物,为V-P反应阳性。

有些细菌发酵糖类产生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,使发酵液的pH下降到4.2以下,当加入甲基红试剂后,使发酵液变红色。

某种微生物能以某种糖类为碳源,产酸产气,则判断为发酵这种糖。

实验材料和方法:
材料:
培养基:葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖和蔗糖)、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基;
菌种:大肠杆菌(E. coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus arueus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum);
试剂:V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素;
仪器及用具:酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。

实验方法:
1.V-P反应
取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管,以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中,空白对照不接种。

置于37℃恒温箱中培养48小时。

取出培养物,分别从中取出2.5mL培养液,再加入等量V-P试剂,充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。

若培养液呈红色,记录为V-P试验阳性反应;无色者为V-P试验阴性反应;粉红色者为弱阳性。

2.甲基红试验
分别从V-P实验中的培养物中取出2.5mL培养液,分别加入2~3滴甲基红指示剂,立即观察培养液颜色变化。

若培养液变成红色,即为阳性反应,橘色或黄色为阴性反应,橘红色为弱阳性。

3.吲哚试验
取5只装有蛋白胨水培养基的试管,以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中,空白对照不接种。

置于37℃恒温箱中培养48小时。

在通风橱中向培养基中加入乙醚1~2mL,振荡使吲哚尽量被完全萃取至乙醚中,沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂,加入后不能摇动。

若乙醚层呈现玫瑰红色,即为吲哚试验阳性反应,否则为阴性反应。

4.糖发酵试验
取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管个4支,内装有倒置杜氏小管,杜氏小管内
充满培养液,每种糖发酵试管中均分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌和普通变形菌,并有空白对照组,置于37℃恒温箱中培养48小时。

与对照试管比较,若接种培养液保持原有颜色,其反应结果为阴性,表明该菌不能利用该种糖;若培养液呈黄色,反应结果为阳性,表明该菌能分解该种糖产酸,若培养液内地杜氏小管内有气泡为阳性反应,表明该菌分解糖能产酸并产气。

5.微生物与氧的关系
在无菌条件下分别向3支酚红半固体培养基中穿刺接种大量枯草杆菌、大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌,可进行三次穿刺接种,然后在37℃恒温箱中培养48小时,观察各种菌种生长状况。

6.抗生素抗菌谱及微生物抗药性
用倒平板法制作两个牛肉膏蛋白胨培养基,待冷却后想两培养基中分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

然后分别将两培养基划分为6个等大的区域,做好标记,分别在6个区域中放置红霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、青霉素和链霉素。

在37℃恒温箱中培养48小时,根据各种抑菌圈的大小判断各种抗生素的抗性。

7.乳酸发酵(酸奶制作)
在一个干净的纸杯中分别加入180ml纯牛奶、10g蔗糖、两勺酸奶,搅拌均匀后在42~45℃条件下培养3小时,然后放入冰箱中培养45小时。

8.细菌数量的测定
稀释:取大肠杆菌菌液,稀释后待用(浓度约为106~107cfu/mL)
加样:用吸管将大肠杆菌稀释液吹吸均匀,然后吸去少量稀释液,从计数板一侧中间平台边缘处加样,让菌液自行渗入并充满计数室,多余菌液用滤纸吸去。

在计数室上方盖上盖玻片。

定位计数室:先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置,转换高倍镜后,适当调暗光亮度至菌体和计数室线条清晰为止,再将计数室一角的小格移至视野中。

顺着大方格线移动计数板,使计数室位于视野中央。

计数:计数时,使用规格为25*16型的计数板,选取左下、左上、右下、右上、中央的5个中方格(各16个小格)计数。

计数时当遇到中方格分界线上的细菌时,则“计上不计下,计左不计右”。

实验结果:
1-4:
试验项目V-P反应甲基红试验吲哚试验
糖发酵试验
葡萄糖乳糖蔗糖
大肠杆菌红色黄色阳性+、○+、○
产气肠杆菌红色黄色阴性+ +(微)
变形杆菌红色黄色阴性+ +(微)+、○枯草芽孢杆菌淡红色红色阳性——————(表一:微生物生理生化的测定结果,+代表产酸,○代表产气)
(V-P反应) (微生物与氧的关系)
(甲基红实验)(吲哚实验)
(糖酵解:葡萄糖,从左至右:大肠杆菌、(糖酵解:蔗糖,从左至右:大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、对照组)产气肠杆菌、变形杆菌、对照组)
(糖酵解:蔗糖,从左至右:大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、对照组)
5.微生物与氧的关系
大肠杆菌:在培养基上下部都生长,上中下均有气泡,基部完全被气体占据;
枯草杆菌:只在培养基表面生长;
丙酮丁醇梭菌:细菌在底部生长,产生大量气体,把培养基顶起。

6.抗生素抗菌谱及微生物抗性
氯霉素氨苄霉素卡那霉素链霉素无菌水
大肠杆菌 3.2 1.6 2.15 3.45 0
金黄色葡萄球菌 1.05 0.75 0.75 0.65 0
(表二:不同抗生素抑菌圈的直径长度,单位:cm)
7.乳酸发酵(酸奶制作)
自制的酸奶美味可口,但味道比市场上的酸奶稍微甜了一些。

可能是蔗糖放多了的原因。

8.细菌数量的测定
视野位置左上左下右上右下中央平均数
细菌数目128 192 180 161 144 161
(表三:平板计数法数每个中格的菌落数)
每立方毫米的菌落数为:161*25*103=4.03*106
分析讨论:
1.V. P. 试验
从实验结果中可以看出,大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阴性,但理论上产气肠杆菌为阳性反应,这可能是实验操作问题,所以原因还待进一步探究。

2.甲基红试验
从实验结果中可以看出,大肠杆菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌都呈阳性,理论结果产气肠杆菌为阴性,这可能是实验操作问题。

3.吲哚实验
实验结果显示大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均产生玫瑰红色的阳性反应,但理论结果是阳性反应还有变形杆菌。

这可能是我们小组实验操作问题。

4.糖发酵试验原理
从实验结果中能够看出,三种细菌(大肠杆菌、变形杆菌、产气肠杆菌)在葡萄糖中发酵都能产酸,只有大肠杆菌能产气(理论上还应该包含产气肠杆菌);在乳糖中,三种菌能够产酸,只有大肠杆菌能产气;在蔗糖中,只有变形杆菌能够产酸产气。

5.微生物与氧的关系
根据实验结果可以得出:大肠杆菌是兼性厌氧性细菌;丙酮丁醇梭菌是厌氧菌;枯草杆菌是好氧菌,所以它一般长在培养基的上面,仔细观察的话,可看到培养基的表面变颜色。

6.抗生素抗菌谱及微生物抗性
通过对抑菌圈直径长度的测量,表明氨苄霉素、氯霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,卡那霉素抑制作用要比前两者弱一些,而链霉素的抑制作用更弱。

观察抑菌圈时一般把培养基对光观察。

有的抑菌圈里有少量菌落的生长,这有可能是其他的杂菌(抗性较强),或是培养基上的菌的突变体。

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