实验六微生物的生理生化反应
一、实验目的
掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。

二、实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

具体个原理如下：
1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。

3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。

酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。

若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。

①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。

本次不做该试验。

②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。

③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。

由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。

④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。

乙酰甲基甲醇在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基中含有胍基的化合物起作用生成红色化合物，即为VP试验阳性。

三、材料和器皿
⑴ 菌种：1号—枯草杆菌，5号—大肠杆菌，7号—产气杆菌；
⑵培养基：淀粉培养基平板（1个），明胶培养基（2个），葡萄糖培养基（2个），葡萄糖蛋白胨水培基（4个），柠檬酸盐培养基斜面（2个）；
⑶试剂：卢氏碘液，溴甲酚紫指示剂，甲基红指示剂，溴麝香草酚兰指示剂，氢氧化钾，α—萘酚。

四、实验步骤
1、淀粉水解试验：制固体淀粉培养基→倒平板→分区标记（将培养皿分成两半，分别标上1和5）→ 接种1号和5号菌（在1号和5号标记的两个区域，分别用接种环蘸取菌液均匀地涂抹于平板上，所接种的菌液涂抹面积不要太大，在两个区域分别接种5个分布均匀，相隔距离适当的菌落）→ 培养两
天→ 加卢氏碘液观察。

2、明胶水解试验：制明胶培养基→标记明胶培养基的两支试管（培养基名称和所接种的菌名1和5）→ 穿刺接种→ 20摄氏度培养2天→ 4摄氏度冰箱十分钟左右→ 取出观察明胶液化状况。

3、糖发酵试验：标记（培养基名称（葡萄糖）和所接菌种名1和5）→ 接种→培养→ 观察颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。

注：指示剂在接种前已加入，观察时无需再加
4、IMAC实验
①甲基红试验（MR）：标记（培养基名称（甲基红）和菌种名5和7）→接种→培养2天→在两支试管中分别加入5滴甲基红试剂→ 振荡→观察颜色变化。

注：甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。

②柠檬酸盐试验：标记（培养基名和菌种名5和7）→接种→培养→观察。

注：在接种前配演技已加入指示剂，观察是不必再加。

③伏-普试验：标记（培养基名和菌种名5和7）→ 接种→培养2天→ 在2支试管中分别滴加5滴（选8滴）氢氧化钾→ 加入等量的5%α—苯酚溶液→ 用力振荡→ 放入37摄氏度温箱中保温15-30分钟，以加快反应速度→取出观察颜色变化。

五、实验结果
六、思考题
大肠埃希菌和产气肠杆菌分解葡萄糖所生成的产物有何不同？
答：①大肠埃希氏菌在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸，进而分解产生甲酸、乙酸和乳酸等多种有机酸；多种酸性物质使溶液的pH值降低至4.2以下，该值位于甲基红的变色范围，在甲基红试验时表现为阳性（红色）；
②产气杆菌在糖代谢过程也产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合、脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者与乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。

此物质可在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰再与培养基中含有胍基的化合物作用生成红色化合物，表现为伏普阳性反应。