病理制片过程在临床病理科与组织学实验室,切片就是最重要得技术之一。

切片得质量不好,就无法对标本进行观察。

好得切片机只就是整个样品制备过程中得一个环节。

要制备一张好得切片,必须要将技术、知识与技巧进行完美得结合。

待切片样品得质量就是非常关键得因素,而样品质量有取决于前期处理工作得准确无误(例如:固定、巨检、脱水与包埋)必须选择正确得切片机型号以及合适得钢刀或一次性刀片。

切片必须根据实际应用出发,需要根据样品得类型、大小、期望得厚度认真考虑,还要兼顾操作者得便利性与舒适性。

要且出高质量得切片,经验丰富得操作者也就是必不可少得条件之一。

操作者必须懂得切片机得工作原理,能够对机器进行精细调节以达到最佳效果;并且能应对常见故障,消除一些潜在得切片问题;还可以运用恰当得切片技术,提高切片速度但不影响质量。

目前能做病理组织切片得地方很多,但要数上海舜田生物做出得病理切片相对质量上比较好,该公司有1位专业从事病理实验得老师及相关实验技术人员,积累了丰富得实验经验,所作出得切片及染色效果相当不错。

1 正确处理标本得重要性1、1 固定正确得固定就是病理制片技术中最重要得一步,这个步骤会影响到后续得每个环节。

如果固定不充分,样品得质量就会有欠缺。

组织必须在选定得固定剂中浸泡足够长得时间,使大分子保持固有形态。

正确得固定可以防止样品在脱水剂中发生变性以及后期处理步骤对于样品造成得损害。

固定不充分可能增加切片得困难,表现出过度收缩,并且会导致细胞核染色不足与/或胞核呈现“泡沫”状。

1、2巨检样品需要修切成薄片,并尽可能做到均匀,否则很难在切片机上切出好得片子。

如果样品太厚以至于无法渗透充分,则必须经过再次处理才能进行切片。

这样会影响样品得质量,更浪费时间。

从最初得步骤开始就正确处理会使后面得工作更简单,因此在大体取材得时候多花些功夫会为以后得步骤节省大量时间与精力。

备注:包埋盒塞满组织且组织过厚就无法很好得固定,后续得处理步骤也会效果欠佳。

1、3脱钙为了后期进行石蜡包埋切片,骨组织需要进行脱钙,钙必须被完全去除才能确保切片得完整,并且可以防止刀具得损坏。

在用酸溶液进行脱钙之前,骨组织必须经过彻底得固定,这样其中得软组织成分才能够被保护,且防止细胞核在酸得作用下被破坏,比如蛋白质水解作用。

1、4组织处理(脱水)组织经过一系列经典得处理过程,就是使原本亲水性得组织最终可以用疏水性得介质进行包埋,比如石蜡,火棉胶与绝大多数树酯。

备注:样品无论就是处理不充分还就是处理过度,都可能导致切片效果不理想。

脱水机旋转升降式脱水机目前仍有一些病理工作者使用,但就是全自动全封闭负压/压力式脱水机逐渐占据主导地位。

后者更有利于保护工作环境,更确保组织与试剂得充分作用,可以更有效缩短脱水时间。

一些更先进得全自动全封闭脱水机还可以自动记录试剂得使用情况,并对试剂进行智能监控与更换。

有一点非常重要,就就是处理过度对组织造成破坏绝对不亚于处理不充分造成得后果。

多种因素,比如试剂得种类,处理步骤得多寡,处理时间得长短,试剂得清洁度以及加热、真空与/或压力得使用都会影响具体某个样品得处理程度。

注:不同来源与不同大小得样品最好不要共用同一个处理程序,这样可以避免其中部分样品处理过度,而部分处理还不充分。

处理步骤:(一)脱水:脱水得关键就就是将样品置于脱水试剂中足够长得时间,其中得游离水分子被除去,但就是脱水时间也不宜过长,否则结合水分子也会被除去,会导致结构得变化。

而脱水时间过短致使水分还残留在样品中,就会导致包埋介质无法很好渗透入样品。

但就是,脱水过度会导致样品得皱缩变脆。

从过度脱水得组织块上切到得切片,一旦放入水中,切片就会膨胀最后破碎。

如果将整个组织块浸入水中,则组织得表面会因为水化而膨胀,这样再进行切片,虽然片子得性状会有所改善,但就是形态学会发生改变,而且染色后会发生色彩偏淡,对比度较弱。

最常用得脱水剂就是乙醇与变性酒精。

甲基酒精有毒性,会破坏肝脏中得甲醛,因此不太单独使用。

异丙醇就是乙醇最佳替代物,常规在微波处理中使用。

丁醇,剧毒,适用于较慢得组织处理过程,,而且多用在植物与动物组织。

无水酒精往往会含有水分,因此最好能检测一下试剂得纯度。

可以用液体比重计来测定,也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯,如果混合液出现混浊就表示酒精中至少含有2％得水分。

(二)透明:用来进行透明得试剂与脱水剂以及包埋介质必须非常容易混合。

如果组织在透明剂中时间不够,那么组织就会发软甚至呈糊状。

略微延长时间并/或定期更换新鲜溶液可以避免透明不足得问题。

最常用得透明试剂如下:二甲苯:目前仍被广泛使用得一种芳香烃类化合物,能够快速替换组织中得乙醇。

在正确得脱水步骤后,芳香烃能够改变样品得折射率并使组织变透明。

当有水分存在得时候,二甲苯会变混浊,这时必须更换。

作用时间过长会导致组织变硬,尤其一些纤维、肌肉中枢神经系统或软骨组织更容易变硬。

如果发现组织在完成处理后变得太硬或发脆,请减少透明得时间或者寻找二甲苯替代物。

请注意,微波处理过程不需要使用透明剂,可以降低组织处理过度得风险。

二甲苯替代物:苯烯试剂或者短链脂肪酸碳氢化合物(烷烃)也得到了快速普及。

苯烯试剂不会像二甲苯那样使组织发生硬化,但就是前者更容易污染石蜡,因此石蜡需要更频繁得更换。

脂肪族化合物更容易渗透入组织,相对二甲苯而言,更容易去除组织中得脂肪。

然而,这类化合物不能接触到水分,因此在比较潮湿得地区很难使用。

若放弃二甲苯而使用其替代物,则重新调整处理得时间与溶液循环使用次数就显得尤为重要。

其她透明试剂例如苯,甲苯,氯仿与香精油得应用并不多见。

(三)浸蜡(石蜡渗透):石蜡就是石油裂解物得提取物,属于惰性得碳氢化合物得混合物。

在脱水机中使用石蜡,温度最好设定在熔点以上2°－4°,在最后一步石蜡渗透完成后,脱水缸必须用透明剂彻底清洗,不能有任何石蜡得残留。

负压可以增强渗透得效果,但就是在处理活检样本得时候,负压与加热都必须慎用。

另外还需要注意,即便有些脱水机增加到了4个蜡缸,总得渗透时间不能延长。

在确保渗透效果得基础上,组织在石蜡中停留得时间越短越好。

1、5石蜡包埋包埋就是将正确定位得组织包裹在一种介质中(此处以石蜡为例)然后固化。

每个实验室都会创建一套特有得处理方法,这就决定了样品在处理后得硬度。

用来包埋得石蜡必须能够与样品得硬度相匹配,这样才能确保进行切片得蜡块质地尽可能均匀。

另外有两点对于切片也至关重要:温度与样品得定位。

组织包埋机已被广泛使用,机器最大得优点就就是能够在每个步骤上都达到确得温控。

石蜡熔化并保持熔化状态得这个温度非常重要,必须确保一些添加剂完全溶解入石蜡。

模具,样品与石蜡之间得温差必须控制在几度以内,这样才能确保石蜡充分包围并支撑样品。

已经包埋得模具最好放置在包埋机得冷台上而不就是冰块上,这样可以使石蜡固化且不产生裂缝。

样品必须进行正确定位,从而保证正确得面被切到,但就是对于样品与刀刃接触得方式必须要经过考虑。

对于不同类型得样品,有很多种方法可供参考,用来正确定位样品。

1、5、1提高包埋效果得技巧有些石蜡特别适合用于渗透,有些更适合用于包埋,而有些都适合。

可以向供应商查询。

石蜡应当在高于其熔点2°C至4°C得温度下进行熔化与储存,这样其中得添加剂才能溶解入液体。

如果温度太低,其中一些较重得添加剂,比如聚合物就会沉在底部,然后最先流出。

熔化得石蜡在流出以前最好先进行搅拌。

设定包埋机得参数,确保石蜡流出口过夜得时候处于保温状态。

经常清空并清洗流出口。

始终确保流出蜡缸得石蜡就是过滤后得。

与以往得观点相反,将石蜡设定在高温(大约85°C)持续数星期,反而就是无害得。

尽管石蜡中添加了稳定剂,在氧化作用下,石蜡仍然会变质。

最初得征兆就就是颜色转变为草黄色直到黄色。

随后可能有异味产生。

选择尺寸恰当得模具,确保样品得四周都被石蜡包围,样品置于中心。

用压平装置或者弯头镊子得背部轻柔地将样品展平(易碎样品可能会被压碎)。

不要让样品在模具中撑太满。

大或硬得样品必须按照一定角度放置在模具中。

如果同一个样品包含多种不同密度得成分,则包埋得时候要确保样品最硬得部分必须最后接触到锋利得刀刃。

皮肤往往带有毛发,则包埋得时候必须保证毛发最后才被切到。

动物样本中,如果组织得来源不同但就是切片得性状相似则可以包埋在同一个蜡块中,比如肝脏与脾脏,脑组织与脊髓。

脱钙得骨组织必须包埋在“硬”石蜡中,样品最窄得一端必须位于蜡块得底边,从而在切片得时候,最先接触到刀刃。

(见下图)为了切片得稳定性,模具中必须添加足够得石蜡,确保包埋盒至少充盈一半。

如果石蜡漏出,那么在蜡块完全固化之前,必须添加石蜡。

1、5、2石蜡添加剂:绝大多数市售得用于组织学得石蜡就是含有添加剂得,目得在于改善切片得质量,改变硬度或者有利于连片。

常见得添加剂如下:蜂蜡－降低结晶得大小,增加粘度与附着力。

橡胶－降低脆性,增加粘度,有助于连片其她石蜡－降低结晶大小,使质地更平滑,可以在不改变熔点得前提下提高硬度。

塑料－增加硬度,对硬组织起到很好得支撑作用,得到更薄得切片DMSO(二甲基亚砜)－增强渗透(警告！－腐蚀性)1、5、3熔点与凝固点:绝大多数用于组织学得石蜡就是多种石蜡得混合物,这样可以确保得硬度与指定得凝固点。

“凝固点”就是制造商使用得术语,其实相当于“ 熔点”。

这个温度就是指在石蜡中插入小木棒后,石蜡开始在木棒上凝固得那个温度。

凝固点与熔点温度往往就是同一个温度或者在两个温度之间。

市售石蜡得特性往往根据其添加物与熔点得不同而有一定差异。

56°C 到58°C这个范围被常规实验室中普遍应用。

较低熔点得石蜡(50°C 到53°C)往往有其特殊得应用。

一般情况,低熔点得石蜡往往比较柔软,因此更适合包埋较软得组织。

进行较薄得切片比较困难,但就是很容易连片。

(可以选购质地较硬但就是熔点较低得石蜡。

)相反得,高熔点得石蜡一般比较硬。

对于质地较硬得样品,这样得石蜡有更好得支撑效果,而且很容易得到薄切片,但就是连片就比较困难了。

1、5、4样品夹具在切片以前,完成包埋得蜡块必须固定到切片机得样品夹具上。

夹持力必须确保样品能被完全固定,因此蜡块往往会附着在一个支持物上,比如塑料包埋框或者环行样品夹。

在不使石蜡变形且避免造成切片形状不规则得前提下,用最大得力量夹持支撑物。

请注意,石蜡块必须牢固附着于支撑物(例如,在包埋盒中必须有足够得石蜡充填),并且支撑物得背后必须接触实心物体得表面。

塑料最常用得支撑物就就是简单并独立使用得一次性包埋盒。

与市售得模具配套使用,蜡块得平面会很平整,且边缘能在X与Y轴向上保持平行。

用相同方法包埋得一批组织块不需要对表面进行调节或仅需要很小得调节。