收稿日期:2000-06-24,3论文联系人基金项目:国家自然科学基金(39830240,3980089),国家转基因植物研究专项(J 992A 2023)资助项目作者简介:张 军(1968-),男,在职博士研究生,工作单位为山东省农业科学院.棉花微卫星标记的PA GE 银染快速检测张 军,武耀廷,郭旺珍,张天真3(农业部农作物种质资源与育种重点开放实验室,南京农业大学农学系,南京210095)摘要:利用一种简便、快速的PA GE 银染方法检测了异源四倍体棉花栽培种陆地棉与海岛棉之间的微卫星多态性,并检测到了微卫星在陆地棉品种间的多态及微卫星标记位点在陆地棉品种间的复等位性。
关键词:棉花;微卫星;PA GE ;银染中图分类号:S 562.035.3 文献标识码:A文章编号:100227807(2000)0520267203Fa st Screen i ng of M icrosa tell ite M arkers i n Cotton w ith PAGE sil -ver Sta i n i ng ZHAN G Jun ,W U Yao 2ting ,GUO W ang 2zhen ,ZHAN G T ian 2zhen (A g rono m y D ep a rt m en t ,N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity ;K ey L abora tory of C rop Ger m p las m and B reed ing ,M in istry of A g ricu ltu re ,N anj ing 210095,Ch ina )Abstract :Po lym o rph is m of m icro satellite m ark 2ers betw een cu ltivars of allo tetrap lo id co tton species (Gossyp ium h irsu tum L .)and the seais 2land co tton (G .baba rd ense L .)w as screened u s 2ing a rap id and si m p le m ethod of PA GE silver stain ing .T he po lym o rp h ic and m u ltiallelic char 2acter of m icro satellite m arkers am ong up land co tton cu ltivars w ere iden tified as w ell .Key words :co tton ;m ico satellite ;PA GE ;silverstain ing微卫星(m icro satellite )或短串联重复(STR )又称简单序列重复(SSR )。
是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列,一般为1～6bp S )为重复单位组成的简单串联重复。
其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的,但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列,据此设计引物,即可通过PCR 技术分析核心序列重复次数的变异,在不同的遗传型间检测到多态,称为简单序列长度多态性(SSL P )。
微卫星首先是在人类遗传研究中发现的[1],以后发现在植物中也普遍存在。
现在,微卫星作为一种分子标记技术已经用于植物遗传、育种研究。
Yu 等[2]利用研究开发出的棉花微卫星的引物,进行棉花遗传图谱构建及Q TL 分析。
但是,微卫星的长度很小,一般为100～300bp S ,有时甚至小于100bp S ,其多态性有时仅表现为几个bp S 的差异。
因此一般的琼脂糖凝胶电泳很难检测微卫星的多态性。
早期的研究是在PCR 反应体系中加入一种用放射性同位素标记的脱氧核苷酸底物,利用变性或非变性的PA GE 经放射自显影检测多态性[3,4],这给研究中利用微卫星标记带来很大的麻烦。
利用高分辨率的琼脂糖凝胶电泳可以检测到大多数微卫星的多态[4],但这种琼脂糖凝胶的制备费时、费力。
Panaud 等[5]尝试利用PA GE 银染技术检测微卫星的多态性。
银染的灵敏度非常高,但一般的银染方法操作比较繁琐,不容易控制染色背景,使得结果不稳定。
我们利用一种快速简便的银染方法,通过非变性的PA GE 有效地检测了陆地棉与海岛棉种间及陆地棉种内品种间微卫星的多态性。
1 材料和方法1.1 植物材料陆地棉遗传标准系TM —1、海岛棉高产抗病品系海7124及其杂交F 1。
陆地棉6个栽培品种。
1.2 棉花基因组DNA 的分离纯化参考郭旺珍等[6]的方法。
1.3 微卫星的PCR 扩增PCR 反应体系(67mM T ris 2HC l (pH 8.8),16mM (N H 4)2SO 4,0.002%明胶,0.2mM dN T P S ,762 棉花学报 A cta Go ssyp ii Sinica 2000,12(5):267～2692.5mMM gC l2,正向引物与反向引物(M ap Pairs TM 产品)各0.6ΛM,0.25ΛT aq DNA聚合酶(上海Sangon公司产品),模板DNA20ng)10Λl,反应程序为:95℃变性2m in;94℃变性40s、57℃退火45s、72℃延伸60s,共30个循环;72℃延伸7m in。
1.4 扩增产物的PA GE 银染分析扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶浓度8%～10%,凝胶大小180×120×2mm,电泳缓冲液为1XTB E,恒压500V,电泳1h。
电泳结束后,凝胶用蒸馏水稍冲洗后,按照以下程序进行银染(参考吴冠芸等[7]介绍的方法,稍做修改):固定(10%乙醇、0.5%冰乙酸)6m in,两次;渗透(0.2%硝酸银水溶液)10～12m in;蒸馏水漂洗3m in,两次;0.002%(w v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗2m in;显色(1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛)适度;0.75%。
2 结果与分析2.1 银染的灵敏度利用Sangon的50bp分子量m arker,设置浓度梯度,进行灵敏度实验。
上样量1.0ng则50bp、100bp、150bp、200bp、250bp和300bp片段的量分别为0.027、0.040、0.020、0.053、0.033和0.040ng。
从图1可以看出,这些DNA条带清晰可见,在上样量为0.25ng时也能检测到0.01ng的300bp条带。
而一般的琼脂糖凝胶EB染色仅能检测到1ngDNA。
2.2 微卫星在陆地棉与海岛棉之间的多态性利用50对引物,对TM—1与海7124进行检测,有48对检测到了多态。
图2显示SSR1604在TM-1与海7124之间检测到了两个多态性位点,从其F1的带型可以看出微卫星标记呈现典型的共显性。
2.3 微卫星在陆地棉品种间的多态性与复等位性从图3中可以清楚地看出SSR1604可以检测到品种3,6与品种2,4,5之间有多态性差异,而品种1的谱带明显地与两类都不同。
这说明微卫星标记位点在陆地棉具有复等位的特点。
另外,在图3中箭头所指的品种1与品种2的多态性差异很小,仅为几个bp,这样微小的差异通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以有效地检测到,而用琼脂糖凝胶电泳则难以检测。
3 讨论微卫星作为分子标记具有非常大的优越性,表现在(1)是共显性标记,可以在连锁分析中提供比显性标记(如RA PD)更为丰富的信息;(2)基于PCR技术,有利于标记分析的自动化;(3)微卫星的重复次数具有很高的变异性,因此多态性非常丰富,而且标记位点具有复等位性,这使得即使在种内的栽培品种间也非常容易获得多态性标记位点;(4)微卫星广泛分布于真核生物基因组的编码区与非编码区[1],有利于构建饱和的分子连锁图谱;(5)一旦开发出引物序列,即可在不同的实验室之间共享[8]。
我们利用的引物是根据陆地棉TM-1与海岛棉P i m a3—79之间有差异的微卫星设计的,其在异源四倍体栽培棉种之间的可以检测到丰富的多态性。
虽然在我们的实验中有个别引物没有检测到多态,这很可能与我们所选的海岛棉亲本海7124与P i m a3—79之间的遗传差异有关。
我们在陆地棉的栽培品种之间也检测到了微卫星的多态性差异和标记位点的复等位性。
我们已经筛选到了与棉花高强纤维Q TL连锁的微卫星标记(张天真等,2000,待发表),并正在将微卫星标记用于棉花遗传作图和其它Q TL 分析。
直到最近,检测微卫星主要是两类方法:一是利用高分辨率的琼脂糖凝胶电泳EB染色分析[9],这不可避免地降低了检测的灵敏度和分辨率;二是利用放射性同位素标记PCR反应底物, PA GE 放射性自显影检测,这种方法不仅有受辐射危害的危险,而且操作费时、费力,影响了检测效率,非常不利于遗传作图中大量标记的快速检测。
但其灵敏度和分辨率均较好,因此很多实验室还是倾向于使用该方法[2,10,11]。
而利用溴化乙锭(EB)检测聚丙烯酰胺凝胶中的核酸时,由于凝胶对EB被紫外线激发出的荧光的淬灭,使检测的灵敏度降低。
Panaud等[5,12]介绍的检测微卫星的银染方法,是一种通用于蛋白质和核酸温和的银染程序,它对蛋白质具有很高的染色灵敏度。
因此,染色过程中较难控制染色背景,加之程序稍显繁琐,不利于微卫星标记的大量检测分析。
我们利用非变性的高浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶银染过程中,利用强碱溶液构成的显色液,又在硝酸银溶液渗透之前利用硫代硫酸钠溶液漂洗,有效地控制了染色背景,提高了分辨能力,而整个染色程序不足一个小时时间,使得微卫星的多态性分析简便迅速,并且避免了放射性同位素危害的可能性。
利用这种PA GE 银染检测技862 棉 花 学 报 12卷术,可以快速有效地对大量微卫星标记进行分析,特别有利于利用微卫星标记构建棉花的遗传图谱和对大群体进行标记检测。
这对于微卫星标记在棉花遗传、育种研究中的应用具有重要的意义(见图版)。
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