产品信息
Thermo Scientific
Maxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642
/onebio
分析证书
经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene
目录页码
试剂盒组分 (4)
贮存条件 (4)
产品描述 (4)
重要提示 (5)
RT-qPCR实验方案 (6)
对照反应 (6)
疑难解答 (7)
参考文献 (8)
试剂盒组分
贮存条件
所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述
Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
5×反应混合液包含剩余的反应组分：反应缓冲液、dNTPs、Oligo(dT)18和随机引物。
无核酸酶的水用于反应体系的配制和RNA样本的溶解。
已通过相关检验证明其中不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶、核糖核酸酶和磷酸酶。
重要提示
避免核糖核酸酶污染
RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至为重要。
RNA能够被RNase A降解，而在任何实验环境中都能发现这种稳定的污染物。
本试剂盒中所有成分都经过严格检测，确保其不含RNase。
为了避免污染，实验环境以及所准备的试剂溶液都必须不含RNase。
避免RNase污染的一般建议：
∙使用确保无核酸酶的实验器具，或者用DEPC水处理cDNA合成中所用到的反应管和枪头等。
∙整个实验过程中请戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。
同时实验过程中注意经常更换手套。
∙使用无核酸酶的试剂，包括高纯度的水（如无核酸酶的水，#R0581）。
∙未使用试剂盒时请严格密封保存。
在反转录过程中，所有反应管要确保扣严。
模板RNA
通过标准方法分离的总细胞RNA适用于该试剂盒。
纯化的RNA需确保不含盐分、金属离子、乙醇和苯酚，以防其抑制cDNA合成反应。
对于RT-PCR，模板RNA需确保没有DNA污染。
在cDNA合成之前，可先用无核酸酶的DNase I（#EN0521）去除痕量DNA。
实验中需要逆转录酶负对照反应。
该反应含有除Maxima Enzyme Mix以外的所有其他RT反应组分。
RNA样本质量
在合成cDNA之前需对RNA的完整性进行评估。
真核生物总RNA能够通过琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色来分析检测。
如果总RNA电泳后有18S和28S rRNA的锐利条带，可认为RNA是完整的。
28S RNA条带的亮度大约为18S rRNA条带的两倍。
rRNA条带出现任何拖尾现象都表示mRNA存在降解。
如果这种情况发生，需重新制备总RNA样品。
另外，也可用生物分析仪器（如Agilent 2100）分析总RNA，该仪器能对RNA样本的大致状况，RNA的完整数（RIN）（2）进行定量。
内参基因/目的基因3’:5’完整性分析（3）也能用于检测RNA样本的完整性。
引物
Maxima第一链cDNA合成试剂盒包含Oligo（dT）18引物和随机引物，以引导第一链cDNA的合成。
该引物混合物可确保检测低拷贝转录物时的高灵敏性。
RT-qPCR实验方案
开始前请阅读本手册的重要提示部分（第5页）。
第一链cDNA合成
第一链cDNA合成反应可以以单个反应进行，而对于不同的RNA模板，也可以进行一系列的平行反应。
因此，反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合，也可以将RT反应中除了RNA模板外的所有组分制成预混液。
解冻后，轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分。
冰上放置。
1.的反应管中。
2.
3.25℃孵育10分钟，之后再50℃孵育15分钟。
注：若RNA模板量大于1 μg，则延长反应时间至30分钟。
若RNA模板富含GC或含有大量的二级结构，可将反应温度提高至65℃。
4.85℃加热5分钟以终止反应。
该反转录反应产物能够直接用于qPCR，或者在-20℃条件下存放一周。
如需长时间贮存，推荐贮存于-70℃。
另外应避免cDNA的反复冻融。
qPCR
第一链cDNA合成的产物能够直接用于qPCR。
加入的合成的cDNA第一链产物体积不应超过PCR反应总体积的1/10。
通常情况下，在25 μl体系的qPCR反应中加入2 μl合成的cDNA第一链作为模板。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒适于和Maxima qPCR master mixes （#K0221、#K0231、#K0241、#K0251、#K0261）搭配使用。
对照反应
实验中应利用如下负对照来确认第一链cDNA合成的结果。
Reverse transcriptase minus（RT-）负对照：RT-PCR和RT-qPCR中应利用此负对照来检验RNA样本中基因组DNA的污染情况。
此负对照RT-反应含有除Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分。
无模板负对照（NTC）：此负对照用来检验试剂污染情况。
NTC反应含有除模板以外的所有组分。
疑难解答
参考文献
1.Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, 252-256, 2000.
2.Fleige, S., Pfaffl, M.W., RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance, Mol. Aspects Med., 27, 126-139, 2006.
3.Nolan, T., et al., Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nat. Protoc., 1,
1559-1582, 2006.
注：
本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请US20110251080A1及相应的副本。
购买本产品包括购买非转让许可，以便买方可将本产品用于其内部研究。
本产品的所有其他商业用途，包括但不限于诊断用途、原装或改装转售或利用产品提供商业服务，均需要一份单独的许可证。
欲了解更多关于许可申请的信息，请联系@。
产品使用限制
本产品的开发、设计及销售专供研究和体外试验使用。
本产品不得用于诊断试验或药物开发，也不适合向人或动物注射。
了解本产品的材料安全数据表，请浏览/onebio。
©2012 Thermo Fisher Scientific公司，版权所有。
所有其他商标均归Thermo Fisher Scientific公司或其子公司所有。