反应次数目录号反应次数04 379 012 00150次，包括10次对照反应04 896 866 001100次04 897 030 001200次试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 0011红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2∙2无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)∙3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)∙4黄色/ 紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM∙5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液∙8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物∙9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为04 896 866 001和04 897030 001的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
储存条件及其稳定性请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。
注意：Control RNA(货号04 379 012 001的瓶7)应储存于-70°C条件。
请避免将产品反复冻融！2 产品使用方法2.1 实验前准备样本材料RNA模板：分离的总RNA，mRNA，病毒RNA或体外转录的RNA。
注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂)是必要的。
请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开始)：- 使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。
- 如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。
- 请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。
为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。
为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。
补充信息：想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问/napure.想了解关于使用MagNA Pure LCSystem或MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息，请访问.引物六聚物随机引物∙在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA 模板，可采用60μM的随机引物终浓度。
使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子的产率会降低。
在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。
锚定oligo(dT)18引物∙锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA的1-2%，因此用锚定oligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。
如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。
使用该方法获得的RT-PCR产物具有较强的一致性。
特异性序列引物∙使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2μM。
但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。
如果遇到此类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一链合成反应。
2.2 实验流程标准RT-PCR流程在此提供两种不同的操作流程：A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物。
在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。
∙B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚物随机引物的混合物。
这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo(dT)18引物比起来反应特异性会降低。
∙注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。
流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。
以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。
图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。
单一反应多重反应RNA+引物+水可选：变性10min 65°C冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模板)并分装到各反应管添加模板RNA到每个反应管中置于冰上，添加缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物30min 55°C或1h 50°C六聚物随机引物10min 25°C30min 55°C或1h 50°C85°C失活5min添加1-5 μl至PCR体系或RT-PCR体系准备cDNA合成图1：单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述①使用前先将所有冷冻试剂解冻。
∙开始实验前将所有试剂轻度离心。
∙实验开始后保持将所有试剂置于冰上。
∙②将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。
注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。
模板-引物混合物(1次反应) 成分体积最终浓度总RNA或poly(A)+ mRNA1 μg 总RNA或10 ng poly(A)+ mRNA引物- 以下任选其一：Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50pmol/μl (瓶5)1 μl2.5 μM 或Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl (瓶6)2 μl60 μM或Sequence-Specific Primer 可变0.5-2.5 μMWater, PCR-grade (瓶7或9)可变使总体积为13 μl总体积13 μl以上为初实验的建议浓度。
为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng 到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。
注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA 模板稳定。
③可选步骤：在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。
此步骤可确保RNA 二级结构变性。
∙立即将反应管置于冰上冷却。
∙④在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。
成分体积最终浓度Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)4 μl1×(8 mM MgCl2)Protector RNase Inhibitor,40 U/μl(瓶3)0.5 μl20 UDeoxynucleotide Mix,每种dNTP各10 mM(瓶4)2 μl每种dNTP各1 mMTranscriptor Reverse Transcriptase,20 U/μl(瓶1)0.5 μl10 U最终体积20 μl⑤在反应管中将试剂小心混匀。
∙注意：不要旋涡！将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。
∙反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。
∙⑥根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50pmol/μl 或Sequence-Specific Primer不超过4 kb55°C下30min超过4 kb50°C下60minRandom Hexamer Primer, 600 pmol/μl不超过4 kb25°C下10min，之后55°C下30min超过4 kb25°C下10min，之后50°C下60min⑦加热至85°C维持5min使Transcriptor Reverse Transcriptase失活。
∙将反应管置于冰上以终止反应。
∙反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。
∙⑧此cDNA产物无需经过纯化即可用于PCR反应。
一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。
若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。
∙如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA或cDNA稀释液。