2 2 2 3 3 0 0
0.001
0 1 2 0 1 0 1
MPN 21 28 35 29 36 23 38
95%置信区间
低
4.5 8.7 8.7 8.7 8.7 4.6 8.7
高
42 94 94 94 94 94 110
1
1 1 1 1 1 1 2
0
0 1 1 2 2 3 0
1
2 0 1 0 1 0 0
计数典型和可疑菌落 BGLB肉汤证实试验 36℃±1℃ 18~24h
报告结果
操作要点


样品稀释同第一法。 选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度 接种两个灭菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生 理盐水做个空白对照。将冷至46℃的结晶 紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约15mL倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样 液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。
平板菌落数的选择


选择菌落数在30~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

证实试验


从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。 BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大 肠菌群阳性菌落。
第二法
平板计数法
适用范围与培养基



平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更 精确。 适合用于污染比较严重的样品，但对于污 染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。 所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。
平板计数法的检验程序
检样25g(ml)+225ml稀释液，均质
10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板 36℃±1℃ 18~24h 注：VRBA(结晶紫中性 红胆盐琼脂)又称为： VRB或VRBL



发酵试验判定原则：产气为阳性。 检测步骤减少（不必分离培养），检测时 间缩短24h。 注：如接种量超过1mL，则应用双料LST肉 汤
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）




胆盐可抑制革兰氏阳性菌。 煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的 抑制作用。 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大 肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠 道致病菌。 发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里 有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的 酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为 黄色，同时可看到管底通常有沉淀。
7.2
11 7.4 11 11 15 16 9.2
1.3
3.6 1.3 3.6 3.6 4.5 4.5 1.4
18
38 20 38 42 42 42 38
3
3 3 3 3 3 3 3
0
1 1 1 1 2 2 2
2
0 1 2 3 0 1 2
64
43 75 120 160 93 150 210
17
9 17 37 40 18 37 40
TM 大肠菌群Petrifilm
测试片法原理

PetrifilmTM大肠菌群测试片是一种预先 制备好的培养基系统，含有VRB 培养基， 冷水可溶性凝胶和TTC指示剂，可增强 菌落计数效果。表面覆盖的胶膜，可截 留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培 养结束后计数红点周围有气泡的菌落为 大肠菌群数。
大肠菌群PetrifilmTM 测试片检验程序
主要修改内容

将原标准拆分为大肠菌群、粪大肠菌群和大 肠杆菌计数三个独立的标准方法，标准名称 变化。

大肠菌群的 MPN 法中乳糖胆盐等培养基改为 月桂基硫酸盐胰蛋白眎(LST)肉汤为主的培养 基； 增加了对样品匀液的pH范围要求； MPN法的结果报告由原“每100g（mL）大肠 菌群的 MPN 值”，修改为“每 1 g （ mL ）大 肠菌群的MPN值”；


分布： • 广泛分布于自然环境。 • 来源于人和温血动物的粪便。 卫生学意义 • 大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样 品中是否受到粪便的污染。 • 大肠菌群计数的高低，直接反映了样品 受粪便污染的程度。 • 表示对人体健康是否具有潜在的危险性。

大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌 • 是人类和温血动物肠道菌群，在数量上 占优势。 • 随粪便排出体外后，在外界环境影响下， 其存活时间应与肠道致病菌大致相似或 稍长。 • 检验方法简便，易于检出与计数。 • 对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。
第二法： 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
操作步骤的改变
原标准 初发酵 EMB分离培养 染色，复发酵 报 告 报 告 现标准 LST初发酵 BGLB验证
大肠菌群检验程图(新国标MPN法)
检样 稀释 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h
不产气


根据对样品污染情况的估计,按上述操作， 依次制成系列十倍系列样品匀液。每递增 稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样 品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15min。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时 要进行调节，如有些果汁pH值很低，如果 不进行调节，检验结果的误差可能就会比 较大。


记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未 产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进 行复发酵试验。 注意：以48h±2h为最终观察结果时限。结 果也以此时为最终结果。
第二步：复发酵

用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳 糖胆盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱 内，培养48h±2h，观察产气情况。产气者， 计为大肠菌群阳性管。
4,100
--
使用MPN检索表的注意点



这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、 USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告 单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表 只有40个组合。

当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值 时，如：阳性管数为122，123，232，233 等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)， 使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点， 然后再遵循相关的规则进行查找，最终确 定MPN值。
第一步：初发酵


选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液 体样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释 度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST） 肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过 1mL，则用双料LST肉汤）。 36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有 气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细 小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至 48h±2h。
结果报告

根据大肠菌群阳性管数, 查MPN检索表，报 告每 g (mL)样品中大肠菌群的MPN值。
MPN检索表的应用

MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的 估测。因此MPN值只是活菌密度的估算值， 并不是样品中活菌数的真值。
1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表
阳性管数
0.10
0 0 0 0 0 0 1
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百 分比乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释 倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。 例：10-4样品稀释液1ml在VRBA平板上有 100个典型和可疑菌落，挑取10个接种 BGLB肉汤，证实6个为阳性。则样品大肠 菌群数为： 100×6/10×10-4/g(mL)=6.0×105cfu/g(mL)
结果报告






选取菌落数在15~150之间的测试片作为计数标准。 选择菌落数在15~150之间的稀释度，平均菌落数乘以稀释 倍数报告之。 如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15, 则计数稀释度 最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长，则以(<)1乘以最 低稀释倍数报告之。 如果最高稀释度的菌落数大于150个时，计数最高稀释度的 测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有 代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后 乘以20即为测试片上估算的菌落数 (圆形生长面积为20 cm2)。 最终结果以“cfu/g (mL)”表示。

什么样的菌落必须要做证实试验?


一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型 菌落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的 其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本来大 肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含 有的其他糖类混入了培养基，使得不能分 解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长 出红色菌落，所以需要进行证实实验。
避免人为产生的气泡
1. 测试片上层膜缓慢落下；
2. 吸取样品时避免泡沫吸入；
3. 测试片未凝固时勿挪动；
4. 如果产生人为气泡，要作好标记，这 样才能在判读时和菌落产生气泡区分 开。另外人为气泡一般为不规则状。
结果判读

大肠菌群为红点带气泡的菌落； 圆形边缘上及边缘外的菌落不计数； 注意菌落浓度高的几种情况。
180
180 200 420 420 420 420 430
2
2 2
0
0 1
1
2 0
14
20 15
3.6
4.5 3.7
42
42 42
3
3 3
2
3 3
3
0 1
290
240 460
90