rRNA序列测定和分析方法
1、寡核苷酸编目分析法-30%序列， 发现古生菌
（1）16SrRNA提取--T1核酸酶水 解--同位素标记--电泳分离、放 射自显影技术、电泳图谱，确定 寡核苷酸分子序列
相似性系数法和序列印记法比较亲 缘关系
• 相似性系数法：通过计算相似性 系数SAB值来确定微生物之间的关 系（SAB=2NAB/(NA+NB)
三界生物的主要特征
• 伍斯：用寡核苷酸序列编目分析法
• 三界(域) ：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和 Eukarya(真核生物)
第二节 细菌分类
• 分类(classification)是根据一定的原则(表型特征
相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类， 排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述， 以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定
门Phylum(phybum) 纲Class(Classis) 目Order(Ordo) 科Family(Familia) 属Gennus(Genus) 种Species(Species)
“亚”、“超”、“族”—辅 助单元
分类单元及其等级
• 培养物(culture)，是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。
• 菌株(strain)，从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以 称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变 异型---新的菌株，与野生型区别。
• 种群(population)----是指一定空间中 同种个体的组合。
• 种(species)，是生物分类中基本的分类单元和分类等级，具有共同特征 的亚种组成
“新种”(sp.nov): 新被鉴定的种发表时应在其学名后标上 sp.nov.的符号，新种发表前应将其模式菌株的培养物存放在一 个永久性的保藏机构，并应允许人们从中取得
2、在16SrRNA分子中(系谱分析的分子尺，古化石)，既含有 高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域， 因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究
3、16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析. （5S\16S\23S,120个核苷酸\1540\2900）
4、rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中，且占总RNA的 90%，便于提取（伍斯）。
古生菌、细菌和真核生物的16S(18S)RNA的印记序 列
2、全序列分析法 用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物 进行直接的序列测定
双脱氧核苷终止法测定全序列
系统发育树
• 系统发育树----在研究生物进化和系统分类中，常用一种 树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系，这 种树状分枝的图型被称为系统发育树(phylogenetic tree)，简称系统树
• 命名(nomenclature)是根据命名法规，给每一个
分类群一个专有的名称
• 鉴定(identification或determination)则是指借
助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确 定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微 生物所应归属分类群的过程
分类单元及其等级
七级分类单元 • 界Kingdom(Regnum)
第十二章 微生物的进化、系统发 育和分类鉴定
• 进化的测量指征 的快速鉴定和自动化分析技术
第一节 进化的测量指征
• 高等动植物判断亲缘关系：形态结构、生理生 化、行为习性等表型特征，少量的化石资料
• 微生物：形体微小、结构简单、缺少有性繁殖 过程，依靠表型特征无法测量其系统发育
• 无根树：只是简单表示生物类群之间的系统发育关系， 并不反映进化途径
• 有根树：不仅表示出A、 B、C、D的亲疏，而且反 映出它们有共同的起源及 进化方向
全生命系统树(Olsen和Woese 1993)
• 基因组系列研究表明：在域内和域间存在广泛的 基因水平转移，及真核生物拥有来自细菌或古生 菌的基因，两域之间也有频繁的基因交换。甚至 细菌也可从真核生物域获得基因。
• 序列印记法：通过序列比较后， 若发现某些序列仅为某种(群)微 生物所特有，这些序列即可作为 该种(群)微生物的印记序列
序列印记通常出现在某一特定系统发育群的全部 成员或绝大多数成员。 20世纪70年代末，生命分为三界的理论，就是采 用寡核苷酸编目分析法对大量微生物分析比较后 提出来的
电泳的原理
• 亚种(subspecies)或变种(variety)，当某一个种内的不同菌株存在少数明 显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，将这些菌株 细分成两个或更多的小的分类单元--亚种。亚种是正式分类单元中地位最 低的分类等级。
• 型(form或type)，常指亚种以下的细分
• 属(genus)，是介于种(或亚种)与科之间分类等级，也是生物分类中的基 本分类单元。通常是把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个高一 级的分类单元，称之属。
双命名法 学名 = 属名 + 种名 + 首命人.年 + 现命人.年
词首大写 词首小写 通常学术论文中不写
Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 1872 Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers 1919
学名 = 属名 + 种名 + 亚种或变种名称
• 2、在各种生物中功能同源的大分子
• 3、为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区， 要求所选择的分子序列必须能严格线性排列， 以便进行进一步的分析比较
• 4、根据所比较的各类生物之间的进化距离来 选择适当的分子序列 (选择进化速率低的分子 序列)
rRNA作为进化的分子指征依据
1、rRNA参予生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必 不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变
进化指征的选择:
• 微生物的系统发育，主要是分析和比较生物大分子 的结构特征，特别是蛋白质、RNA和DNA这些反 映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生 物乃至所有生物进化关系的主要指征
• 蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是 进化速率相对恒定
合适的指征大分子
• 1、必须普遍存在于所研究的各个生物类群中