实验五固定化脲酶活力的测定
一、实验原理
固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。

常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。

酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。

氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。

故可测定脲酶活力的大小。

二、仪器和试剂
1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器
2、实验四制备的固定化脲酶
3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏
水并定容至100 ml
4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml
5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶
解并定容至100 ml。

此溶液含NH3为40 µM
6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，
冷却后加水定容至1000 ml
7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。

另
称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐
注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮
于棕色瓶中，密塞保存。

三、实验步骤
1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。

取0.3-0.5 g，切碎。

2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100
mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水
浴中保温5 min。

3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1
号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。

4、20 min后两管同时加入1 ml 1 M H2SO4溶液终止反应。

（V1=12 ml）
5、另取3支试管编号（1号、3号与上对应，2号为标准氨溶液），按下表加
入试剂：（V2=0.1 ml）
摇匀后在30 min内，480 nm波长下比色测定吸光度，分别记为A3（样品），A2（标准），A1（空白）。

定义脲酶在30℃，中性条件下，每分钟水解底物产生1 µmol氨的酶量，为1个酶活力单位。

四、结果计算
100 mg脲酶所得到固定化酶的总活力（U）：
（A3—A1）×m1×V1×NH3的摩尔数
U= ×100%
（A2—A1）×m2×V2×t。