《生物工程下游技术实验》讲义实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)过程1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。
2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。
SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。
●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法溶液配制：1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。
共配500ml.2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..操作：25︒C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（∆Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（∆Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的∆Ａ’在0.035/min左右。
（以上∆Ａ∆Ａ’的变化值不需特别严格，∆Ａ只要控制在0.1以下0.04以上，∆Ａ’变化在∆Ａ的约一半左右即可）一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit，U）。
加入酶量相当的酶活力单位（unit）＝(∆Ａ-∆Ａ’)/∆Ａ×２提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=加入酶量相当的酶活力单位×(反应液总体积/取样液体积)×稀释倍数比活(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）●思考并回答：1，控制不加SOD时的OD值变化在0.07/分钟左右。
2，加SOD酶量控制在加酶后使OD值的变化在0.035-0.04/分钟左右。
3，理解一个酶活性单位的定义。
4，提取过程应该在每一步骤测量总活力和比活力，为什么？（总酶活及比活在酶的分离提纯过程中的意义）二、NBT光化还原法测SOD活性（选做）试剂母液：A：甲硫氨酸( methionine): 215.6mg---100mlB: NBT（氮兰四唑Nitroblue Tetrazdinna）: 9.2 mg----5 ml (一定要现配)C: 核黄素：1.13 mg----50 mlD: EDTA：87.68 mg------50 ml ( 一般用EDTA-Na2)以上溶液全部用pH 7.8 0.05M的磷酸缓冲液配制.操作：每3ml 反应液中含有：A 2.7 ml(13 mmol), B 100 μl (63 μmol), C 100 μl (1.3 μmol), D 100 μl, 加酶液后于4000 lux 光照15分钟，以不加酶液的反应液为对照(空白A560)，以不照光不加酶液的反应液调节零点，测A560 （空白A560控制在0.5左右，加酶液量控制在使A560在0.25左右）酶活（unit/ml）= (空白A560-A560)/空白A560*2*3/ 加样体积ml三、Bradford法测定蛋白质的含量实验目的:●学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法，包括：①熟练掌握分光光度法定量测量物质含量的技术，了解误差的来源及避免的原则；②熟悉分光光度计的操作；③熟悉标准曲线的绘制（电脑和手工绘制）；④从标准曲线求得求知物质含量的方法（直接读数和根据公式计算）⑤蛋白质含量/g样品的计算●一定浓度溶液的配制（计算、称量和定容）●天平的使用●离心机的使用●移液管、移液枪、的使用实验原理:●考马斯亮蓝具有红色和蓝色两种色调,在酸性溶液中其以游游离态存在时呈棕红色,当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色(在595 nm处有最大吸收值).该反应灵敏度很高,反应速度快,约在2 min左右达到平衡,在室温1小时内稳定.在0.001~1.0 mg蛋白质范围内,蛋白质浓度与A595值成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.●一些阳离子(如K+,Na+, Mg2+), (NH4)2SO4, 乙醇等不干扰测定,而大量去污剂如TritonX-100, SDS等严重干扰测定,少量去污剂可通过用适当的对照而消除.实验器材:●分光光度计,试管及试管架,比色皿,移液管;移液枪实验材料与试剂:●考马斯亮蓝G-250 (0.01%, W/V): 100mg 考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%的乙醇中,加入100ml 85% 的磷酸,将溶液用水定容到1000 ml,过滤得清液于棕色瓶中备用.●标准蛋白质溶液:牛血清蛋白(BSA)用蒸馏水配成0.1mg/ml●待测样品液:S1,S2 (3颗绿豆—10ml水---研磨---离心2500rpm得清液),S3,S4为原液稀释10倍（S1S2S3S4均为样品体积，S3和S4不一定做，在未知样品蛋白含量时可先设计一个浓度梯度以保证测量值在标准曲线的线性范围内）操作方法:1.牛血清蛋白标准曲线的制作:●按下表加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,测下各管的A595值,以吸光值取未知浓度的蛋白质(通过适当稀释使其浓度控制在测量有有效范围内),加到试管内,再加入G250染色液3ml混匀,测其595nm下的吸光度,对照标准曲线求出蛋白质含量,计算其浓度.（表示为mgPr/g材料）思考题:3.Bradford 法测定蛋白质测定蛋白质含量有什么优点?4.你觉得Bradford法测定蛋白质含量有什么缺点？如何避免？5.理解零点的调节实验二：植物材料破碎及硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩①植物材料的破碎；固液分离方法；②分级沉淀------硫酸铵或有机溶剂分级分离③粗提物的透析除盐和浓缩过程：1．准备透析袋：透析袋事先预处理，Na2CO3 10g/L, EDTA 1 mmol/L 煮沸30分钟，蒸馏水洗涤，并浸泡于5℃中备用。
2．实验一所得清液测量其部体积，缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（18.4g/100ml）（过程充分搅拌），5℃静置至分层澄清，离心除去清液，得沉淀。
3．沉淀溶于水并定容到一定体积，装入透析袋，于蒸溜水中透析过夜。
4．透析后溶液用滤纸过滤得清液。
重新装入透析袋中用PEG6000包埋进行浓缩。
●要求：测量沉淀和清液、浓缩液的SOD活性、蛋白质含量以计算总酶活和比活性的变化，评价本提取步骤的效率。
实验三：葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD分离效果及产品质量分析上述浓缩液过滤后得清液，用葡聚糖Sephadex G100进行层析分离，层析过程参见《基础生物化学实验》（第二版，高等教育出版社）P2361．实验目的:①.掌握层析分离的基本技术;②.理解凝胶排阻层析的原理,掌握葡聚糖凝胶色谱的装柱、上样、洗脱技术。
2．实验原理：利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法。
其基本原理是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部.较小的分子可以通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部.从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离的目的.3．实验基本操作：①.葡聚糖的预处理：●水中膨化：根据其吸水率加入适量（略大于吸水率）蒸馏水，在20℃条件下需24h；如果加热煮沸，膨化时间会大大缩短，一般在4 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。
应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。
吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。
●排除凝胶中气泡：膨化处理后，通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡②.装柱：●先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。
关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。
●调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。
但稀释度太高则一次装柱的高度不够。
●将一根直径稍小的玻璃棒插入层析柱底部，沿玻璃棒将胶浆徐徐注人柱内，一边灌胶，一边提起玻棒。
注意避免产生气泡。
柱要一次装完。
●柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。
●柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。
再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。
流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来（层析柱平衡过程,1ml/min,1.5h）。
●调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。
（1ml/min）③.加样：上述浓缩液过滤后得清液加样，要尽量快速、均匀。
一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～5％(质量分数)左右.（这里用5%）。
加样应加于柱中心，避免沿柱壁加入。
④.洗脱：（pH 7.0, 0.02mol/l磷酸缓冲液）洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。
保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。
洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。
但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；（这里采用1ml/min,一般每一收集部份不大于2ml，本实验因为仪器的数量问题，每份收集4ml,收集液总体积为柱床总体积的1.2倍即完成收集）。
4．结果分析：①.每一组分测量其A280吸收做为蛋白质含量的相对值，绘出洗脱曲线；②.每一组份测量其SOD活性，绘出活性物质洗脱曲线；③.根据SOD活性分布决定收集洗脱液的部分；收集活性峰及其上下各1试管的洗脱液。
④.对SOD纯化率及得率进行分析并完成实验报告（请尽量按标准完成）。