实验九酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求
掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。

2．方法原理
酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。

以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。

它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。

3．主要实验仪器及材料
干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。

4．掌握要点
掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。

5．实验内容
（1）酶液提取。

称取1g样品，用5mL研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm下离心10min。

吸出上清液，即为酶粗提液。

可放在冰箱中储存备用。

（2）活力测定。

取酶液0.1—1mL（视酶含量多少而定），加水至1mL，然后加入缓冲液1mL和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL。

空白对照用1mL研磨缓冲液代替酶制剂。

充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min，时而摇动。

10min后，加入1m0.5mol/LNaOH溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。

在400nm波长下测吸光度A。

（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol数表示。

酶活性nmol/min.mg=
）
（
）
（
试样的
g
W
V
V
A
⨯
⨯
⨯
min
10
1
1.3
019
.0
式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L时，其A=0.019；
3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol化为nmol乘上1000；
V为酶制剂总体积；
V1为每次用酶体积。

在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。