1材料与方法1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8荧光抗体)。

1. 2 动物与分组Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。

颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。

动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二:测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血清半数溶血值。

每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和CTX-2 组。

1. 3 实验方法和测定指标1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。

CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。

另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。

动物灌胃容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周后测定各项免疫指标。

1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行测定，每管加入50μl 抗凝血。

分别在3 管中加入CD3 /CD19，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。

每管加入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。

1200r /min 离心5min，弃去上清液。

每管再加入2ml PBS，1200r /min离心5min，弃去上清液。

加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。

1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。

用Hank＇s 液洗2 次，每次离心10min(1000r /min)。

弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。

1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于15ml 离心管中，计数细胞。

加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。

用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴30min。

用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮P815 细胞，室温孵育15 ～ 20min 后，离心1 次。

将P815 悬浮于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 × 106 个/ ml，加0. 5ml 此悬液于含有脾细胞悬液的24 孔( 包括对照孔) 板中。

37℃、5% CO2孵育5 天。

5 天期间，每隔一天换一次液。

1. 3. 3. 3 制备效应细胞收集24 孔培养板中的培养物，用Hank’s 液洗1 次，200r /min 离心10min，收集细胞，重悬于RPMI1640 培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 × 107 / ml。

用完全培养液配制3 个系列稀释的细胞悬液，每个稀释度100μl，做3 个复孔。

1. 3. 3. 4 制备靶细胞离心处于对数生长期的P815 细胞，重悬于0. 5ml Hank’s 液里，离心后重悬于RPMI1640 完全培养液，调整细胞浓度为2 × 105 个/ml。

1. 3. 3. 5 CTL 检测按效应细胞和靶细胞比为100∶ 1、50∶ 1、25∶ 1和12. 5∶ 1( 各加100μl) 在圆孔96 孔培养板的培养孔中加入细胞，每孔液体总体积为200μl，设3 个复孔。

同时设靶细胞自然释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1m 培养液) 和最大释放对照组(0. 1ml 靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40 液) ，效应细胞对照孔(0. 1ml 效应细胞+ 0. 1ml 培养液) ，用96 孔板水平转头500r /min 离心5min，37℃、5% CO2培养4 ～ 6h。

1000r /min离心5min，每孔吸取100μl 上清，加于另一ELISA 反应板的孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50μl，室温避光反应30min 后，每孔加入50μl 终止液，终止酶促反应。

在酶联检测仪492nm 波长下读取各孔A 值，CTL 活性用杀伤率表示，按如下公式计算:CTL 杀伤率(% ) = ( 实验孔A 值－靶细胞对照孔A 值－效应细胞对照孔A 值) / ( 靶细胞最大释放孔A值－靶细胞对照孔A 值) × 100% 。

1. 3. 4 NK 细胞活性测定1. 3. 4. 1 靶细胞传代实验前24h 将靶细胞进行传代培养，应用前以Hank’s 液洗2 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4 × 105 个_______/ml。

1. 3. 4. 2 效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度。

效应细胞的数量为5 × 106 个/ml，效应细胞和靶细胞之比为50∶ 1。

1. 3. 4. 3 NK 细胞活性测定反应孔加靶细胞和效应细胞各100μl 于96 孔U 形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% 的NP40或2. 5% Triton 各100μl，每样做3 个平行样。

37℃、5% CO2 条件下培养4h。

培养结束后，96 孔培养板1500r /min 离心5min，每孔吸取上清100μl 置于平底96 孔板中，同时加入LDH 基质液100μl，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L 的HCl 30μl，在酶标仪490nm 处测定A 值。

用下列公式计算:NK 细胞活性(% ) = ( 反应孔A 值－靶细胞自然释放孔A值) / ( 最大释放孔A 值－靶细胞自然释放孔A 值) × 100% 。

1. 3. 5 半数溶血值的测定(HC50)1. 3. 5. 1 制备补体采集豚鼠血，分离出血清( 至少5 只豚鼠的混合血清) ，将1ml 压积SRBC 加入到5ml 豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，－ 70℃保存。

用时以SA 液按1∶ 8稀释。

第3 期齐丽娟，等. 用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型3151. 3. 5. 2 免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞( SRBC) ，并用生理盐水配成2% ( V /V) 的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0. 2ml 进行免疫。

4 ～ 5 天后，由动物眼眶内眦静脉取血，2000r /min 离心10min 收集血清。

1. 3. 5. 3 溶血反应取血清用SA 缓冲液稀释( 一般为200 ～ 500 倍)。

将稀释后的血清1ml 置试管内，依次加入10% SRBC 0. 5ml，补体1ml( 用SA 液按1∶ 8稀释)。

另设不加血清的对照管( 以SA 缓冲液代替)。

置37℃恒温水浴中保温15 ～ 30min 后，冰浴终止反应。

2000r /min 离心10min。

取上清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml 加都氏试剂至4ml，充分混匀，放置10min 后，于540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。

按下列公式计算HC50。

HC50 =样品光密度值SRBC 半数溶血时的光密度值×稀释倍数1. 4 统计分析采用SPSS 13. 0 统计软件进行方差分析或非参数检验。

2 结果2. 1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响由表1 可见，CTX-1 组和CTX-2 组小鼠体重较对照组显著降低(P < 0. 001)。

CTX-1 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组增高(P < 0. 001) ，CTX-2 组小鼠脾脏绝对和相对重量较对照组降低(P < 0. 001，P < 0. 05)。

表1 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠体重及免疫器官重量的影响Table 1 The weight and absolute and relativespleen weight in each group( n = 8，珔x ± s)组别体重( g)脾脏绝对重量( g) 相对重量(% )对照组22. 36 ± 1. 06 0. 071 ± 0. 007 0. 319 ± 0. 031 CTX-1 组16. 31 ± 2. 05 (3) 0. 081 ± 0. 018 (1) 0. 505 ± 0. 142 (2)CTX-2 组19. 18 ± 0. 48 (3) 0. 047 ± 0. 009 (2) 0. 243 ± 0. 042 (1)注:与对照组比较(1) P < 0. 05，(2) P < 0. 0012. 2 CTX 不同给药方法对Balb /C 小鼠淋巴细胞分类计数的影响由表2 可见，CTX-1 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B淋巴细胞( CD －3 CD +19) (% )、T 淋巴细胞( CD +3 CD －19) (% )、Th细胞(CD +3 CD +4 CD －8) (% ) 和Ts 细胞( CD +3 CD －4 CD + 8) (% ) 及Th /Ts 比值均较对照组显著降低(P < 0. 05) ;CTX-2 组小鼠外周血LYM 和LYM(% )、B 淋巴细胞(% ) 较对照组降低( P < 0. 001) ; CTX-2 组小鼠外周血T 淋巴细胞(% )、Th 细胞(% )、Ts 细胞(% ) 及Th /Ts 比值较对照组增高( P < 0. 001，P < 0. 001，P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 001)。