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(三）、操作（标准曲线制作） ：
取7支试管按下表操作：
空白 待测 标1 标2 标3 标4 标5
标准蛋白 （微升）
待测样品2（微升）
生理盐水（微升） 100
CBB-G250(ml)
5.0
20. 40. 60. 80. 100. 5.0
95 80 60 40 20 0.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
最终蛋白浓度（微克/毫升）
4.0 8.0 12 16.0 20.0
混匀，室温放置3分钟，在595nm测定各管O.D
值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲
线．
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❖以Bradford法测定血清和层析分离 蛋白内的蛋白浓度
取2支试管分别从血清样品和层析样品 中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入 考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以 595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上 查出其蛋白浓度。
E.移液管
2F02.0试/12/1管0 与试管架来自2（2）、试剂
A. 9 g/L NaCl 溶液 B. 标准牛血清白蛋白溶液
牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容 至 100毫升。 C. 待测血清样品 取兔血清0.1毫升，用生理盐水稀释 至 20毫升。
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3、操作
取3支试管按下表操作：
液中，然后加入100毫升 850 ml/L 磷酸，最后加蒸馏
2水020定/12/1容0 至1000毫升。
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❖ （2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）
❖ （3）标准蛋白质溶液（1mg/ml）： 精确称取100毫克牛血清白蛋白，用生理
盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释4倍) (5) 层析样品(前次层析实验分离的原液)
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也可 分别测定各管280nm处的O.D值，以蛋白浓度 为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。
根据未知蛋白的O.D 值，可在标准曲线上查出该蛋 白的浓度。
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二、Bradford法
(一）、原理：
考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后 形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且
Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择
适20当20/1的2/10 对照品来消除。
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（二）器材及试剂
1、器材 A. 分光光度计 B. 微量加样器 C. 移液管、试管及试管架 D. 坐标纸
2. 试剂
（1）考马斯亮蓝G-250溶液：
称取CBB- G-250 100毫克 溶于 50 ml 950ml/L乙醇溶
空白 标准 测定
标准蛋白 （1 mg/ml） 0 0.5 0
待测样品1 （ml）
0 0 0.5
生理盐水 (ml)
4.0 3.5 3.5
轻轻混匀放置３分钟，在２８０nm处以空
白调零，测定各管光密度，计算蛋白含量．
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计算公式：
测定O.D/标准O.D X 标准浓度X稀释倍数 =待测样品蛋白浓度（mg/ml)
实验四、
紫外吸收法和Bradford法 检测蛋白质浓度
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一、紫外吸收法
1、原理： 蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有
最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标 准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。
2、器材与试剂
（1）、器材
A.紫外分光光度计
B.坐标纸
C.恒温水浴
D.微量加样器
蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准
确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250
在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保
持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，
更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十
二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），