(3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋 白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶 中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/mL。
(4)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品 溶液。
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【实验操作】
1. 绘制标准曲线 取7支试管，按下表分别加入各试剂
(2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠
(Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸及 100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL蒸
馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定
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【实验原理】
该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度 范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用 比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质 浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时 （25100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(525μg) 在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线 求出未知样品中蛋白质的含量。
(2)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为 未知样品溶液。
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【实验操作】
1. 绘制标准曲线
取 7 支试管按下列各表加入各试剂：
试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0 号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制 出标准曲线。
紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简 便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因 此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
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【实验材料】
1.实验器材
试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外 分光光度计。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／mL的酪蛋白 溶液。
容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置
于棕色瓶中暗处保存。.
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【实验材料】
使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试 剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤 液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释 (约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下测定其 光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查 出样品溶液的蛋白质含量。
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【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【实验原理】
凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时， 则可用此法测定样品中蛋白质的含量。
实验 蛋白质的定量测定方法
【实验预习】
1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法 的优缺点。
2 .试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。
3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫 酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？
4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？
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一、Folin酚试剂法(Lowry法)
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【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量. 。
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二、紫外吸收法
【实验目的】
1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
【实验原理】
大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色 氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收， 并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利 用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳 和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程 通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加 入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂， 以促进反应的进行。
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消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的 硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨 蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后， 氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指 示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液 中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算 出待测物中的总氮量。
【实验目的】
1.学习Folin 酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还 原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子 中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质Cu2+复合物；第二 步：蛋白质Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中 的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克 蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品 中蛋白质的含量。
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【实验材料】 1.实验器材 微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠 2.试验试剂 (1)浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01mol／L)。 (2) 粉末硫酸钾—硫酸铜混合物： K2SO4与CuSO4∙5H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1％甲 基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。 (4)样品溶液：配制3mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含
量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。 Nhomakorabea.
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【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中， 再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液， 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
各管加入Fo1in酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在
500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标
准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升
Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值