由低到高依次为卡泊芬净、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素Ｂ；土曲霉 对两性霉素Ｂ的ＭＩＣ均＞３２岭／ｍｌ。ＭａＳｔｅｒＰｕｒｅ刑Ｙｅａｓｔ
ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ提取的
ＤＮＡ量很低，固体培养＋液氮研磨方法、液体培养＋液氮研磨方法以及固体培养＋液
氮研磨＋试剂盒纯化方法提取的ＤＮＡＯＤ２６徊Ｄ２８０的均值分别为１．７３、１．９６和１．８０。烟
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第三部分曲霉菌ＤＮＡ提取方法和真菌菌种保藏方法的初步探索………２３
第四部分实时荧光ＰＣＲ鉴定曲霉菌方法的建立及评价……………．．３４ 全文结论………………………………………………．．６８ 文献综述………………………………………………．．７０ 参考文献………………………………………………．．７７ 缩略词表………………………………………………．．８５ 论文列表………………………………………………．．８６ 个人简历………………………………………………．．８７
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曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉种特异性探针Ｔｍ值分别为６１．４℃、５７．４℃、６７．７℃、 ６５．８℃，土曲霉特异性探针的Ｔｍ值为６４．５℃和５５．２℃。实时荧光ＰＣＲ方法对烟曲 霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的检测下限分别为５６．８龟、１１１０龟、１３．７龟、 １２３龟、７８０龟。疣状瓶霉和小孢根霉能与烟曲霉特异性探针发生交叉反应。该方法 在每次重复实验中Ｔｍ值的波动在Ｏ．５℃以内。
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【结果】形态学观察基本上能将临床常见的５种曲霉菌鉴定到种，对于其他种属形 态学可以将其鉴定到属的水平，但是较难鉴定到种。卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、
构巢曲霉的ＭＩＣ９０均为Ｏ．０９４“ｇ枷，对黑曲霉的ＭＩＣ９０为Ｏ．１９ｐｇ／ｍｌ，在５种药物中最
低；泊沙康唑对土曲霉的ＭＩＣ９０最低，为０．０９４“咖ｌ；对于烟曲霉和黄曲霉，ＭＩＣ９０
【方法】对所收集的真菌通过形态学和／或分子生物学鉴定，采用浓度梯度法（Ｅ．ｔｅｓｔ） 测定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素Ｂ及卡泊芬净对５种曲霉菌的最低 抑菌浓度（ＭＩＣ）；采用液氮研磨、试剂盒纯化方法提取曲霉菌细胞核ＤＮＡ，普通 ＰＣＲ方法扩增５种（４７株）曲霉菌的内转录间隔区（ＩＴＳ），测序获得ＩＴＳ区序列， 基于不同种曲霉菌的ＩＴＳ区序列对种特异性探针进行验证和改进，建立实时荧光 ＰＣＲ方法将常见曲霉菌通过特异性探针解链温度（Ｔｍ）的差异进行区分并对该方 法的灵敏度、特异性及重复性进行评价。
北京协和医学院硕士研究生学位论文
【结论】形态学结合ｒＤＮＡＩＴＳ区测序对真菌种的鉴定很有帮助。Ｅｔｅｓｔ法体外药敏 结果显示，新的棘白素类抗真菌药物卡泊芬净对五种曲霉具有很好的体外抗菌活 性，唑类药物对于曲霉菌的体外抗茵活性优于两性霉素Ｂ。采用固体培养＋液氮研 磨法＋试剂盒纯化法能获得高纯度的曲霉菌ＤＮＡ。实时荧光ＰＣＲ方法具有很好的灵 敏度、特异性和重复性，能将临床常见的５种曲霉鉴定到种的水平。
致 声
谢………………………………………………．．８９ 明………………………………………………．．９０
北京协和医学院硕士研究生学位论文
中文摘要
【目的】探讨临床常见曲霉菌（烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉） 对经典的抗真菌药物伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素Ｂ和新的抗真菌药物泊沙康唑、 卡泊芬净的体外敏感性：建立应用实时荧光ＰＣＲ技术将临床常见曲霉菌鉴定至种 的水平。
【关键词】曲霉菌；鉴定：实时荧光ＰＣＲ；种特异性探针；解链曲线分析
２
北京协和医学院硕士研究生学位论文
Ａｂｓｔｒａｃｔ
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目录
中文摘要…………………………………………………１ 英文摘要…………………………………………………３
前 刖
言…………………………………………………５ 青…………………………………………………ｂ
第一部分菌株收集及鉴定……………………………………７ 第二部分抗真菌药物体外敏感性研究…………………………．１５
【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＦｕＩｌｇｉ
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