研究生植物生理学实验教案教师：***农学院生物技术系实验一 植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（•2O ）的酶，它催化下列反应：2反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生•2O ，•2O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除•2O 从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx ）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称取1.939 9g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml 。

4．750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液：称取61.33mg NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，现配先用，避光保存。

5．100μmol/L EDTA-Na 2溶液：取37.21mg EDTA-Na 2用磷酸缓冲液定容至1 000ml 。

6．20μmol/L 核黄素溶液：取7.53mg 核黄素定容至1 000ml 避光保存。

【材料与方法】1．酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml 离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml 。

于10 000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。

2．显色反应：取试管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其他各管于4000lx 日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度）。

【结果处理】SOD 活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm 波长下的吸光度值，已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表222SOD 2O O H H 2O ＋＋＋−−→−•22CAT 22O O H 2O H 2＋−−→−示。

按下式计算SOD 活性： SOD 总活性（U ·g -1FW ）=式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；A 0—照光对照管的吸光度值； A S —样品管的吸光度值； V T —样液总体积（ml ）； V 1—测定时样品用量（ml ）； FW —样重（g ）；表1-1 各溶液加入量试 剂（酶） 测定管用量(ml)空白和对照管用量（ml ）0.05mol/L 磷酸缓冲液130mmol/L Met 溶液 750μmol/L NBT 溶液 100μmol/L EDTA-Na 2液 20μmol/L 核黄素 酶液 蒸馏水 总体积1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.01.5 0.3 0.3 0.3 0.3加缓冲液0.050.25 3.0【注意事项】1. 显色反应过程中要随时观察光下对照管的颜色变化，当A 0达到0.6-0.8时终止反应。

2. 当光下对照管反应颜色达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显色或颜色过淡，说明酶对NBT 的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显色，以能抑制显色反应的50%为最佳。

3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷酮（PVPP ）消除之 【思考题】1．在SOD 测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？ 2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？二、过氧化氢酶活性的测定（采用滴定法）【原理】H 2O 2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A 240)随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶；0.5ml 刻度吸管；2ml 刻度吸管；10ml 试管；恒温水浴锅； 【试剂】1. 0.2mol ／L pH7.8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；2. 0.l mol ／L H 2O 2 ：市售30% H 2O 2 大约等于17.6mol/L ，取30% H 2O 2 溶液5.68ml ，稀释至1000ml 。

(用0.1mol ／L 高锰酸钾标定)。

【材料与方法】1．酶液提取：称取剪碎的植物样品1.0g 置研钵中，加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml 刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵2～3次，合并冲洗液，并定容到刻度，摇匀。

取部分提取液在4 000r/min 下离心15min ，上清液1005.0)(V FW A V A A T S ⨯⨯⨯⨯-即为过氧化氢酶粗提液。

2．测定：取10ml 试管4支，其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序加入试剂。

25℃预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol ／L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中（可在比色杯中直接加H 2O 2），240nm 下测定吸光度(蒸馏水调零)，每隔lmin 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

【结果处理】以lmin 内A 240减少0.1为1个酶活单位(U )。

过氧化氢酶活性（U /gFW/min ）=FWt V VrA ⨯⨯⨯⨯∆12401.03)(321240S S S SO A A A A A ++-=∆式中A so —加入煮死酶液的对照管吸光值； A sl , A s2, A s3—样品管吸光度值； Vt —粗酶提取液总体积(ml)；V 1—测定用粗酶液体积(ml)； FW —样品鲜重(g)：0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位(u )： t —加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

【注意事项】 1. 所用KMnO 4溶液及H 2O 2溶液临用前要经过重新标定。

2. 凡在240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】1．影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? 2．过氧化氢酶与哪些生化过程有关?三、过氧化物酶活性的测定过氧化物酶（POD ）通过催化酚类物质与H 2O 2反应生成醌类来清除植物体内的H 2O 2。

过氧化物酶还与生长素、NADH 、NADPH 的氧化有关，在植物代谢中起着重要作用。

【原理】愈创木酚（邻甲氧基苯酚）可作为过氧化物酶的底物，与H 2O 2反应生成茶褐色产物。

该物质在470nm 处有最大吸收峰，故可利用分光光度计测定过氧化物酶的活性。

【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；5ml 量筒；25ml 容量瓶；微量进样器；秒表。

【试剂】1. 100 mmol ／L PH6.0磷酸缓冲液。

2. 反应混合液：100 mmol ／L PH6.0磷酸缓冲液50ml 于烧杯中，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中。

【材料与方法】1.酶液的提取称取剪碎的植物样品2.0g置研钵中，加适量的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，将匀浆全部转入离心管中，以4000g离心10min，上清液转入25ml容量瓶。

沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶，定容至25ml，低温下保存备用。

（酶浓度太高，样品数可少至1g）2.过氧化物酶活性的测定取两个光径1cm比色杯，于1个比色杯中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为较零对照；另一个比色杯中加入反应混合液3ml和粗酶液1ml(如酶活力过高可适当稀释)，立即开启秒表记录时间，于470nm进行比色测定，每隔1min记录一次吸光度值，共记录5min，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位。

【结果处理】以lmin内A470变化0.01为1个酶活单位(U)。

过氧化物酶活性（U/gFW/min）=△A470V/0.01WV t t式中△A470反应时间内吸光度的变化；V—为酶提取液总量(ml)；V t—为反应系统中加入的酶液量(ml)；W—样品重(g)：t—反应时间(min)。

【思考题】1．在此实验者A470反应时间如何掌握?2．使用愈创木酚溶液时要注意什么？为什么?实验二植物渗透调节能力的测定一、游离脯氨酸含量的测定植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。

因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

【原理】采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。

脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

【仪器与用具】分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管；20ml具塞刻度试管；5～10ml注射器或滴管。

【试剂】1．3%磺基水杨酸水溶液；甲苯。

2．2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3∶2混合，作为溶剂进行配制，可加热至70℃使其溶解，贮于棕色瓶中（此液在4℃下2～3日有效）。

3．脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。

再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。

【材料与方法】1．标准曲线制作：（1）取7支具塞刻度试管按表2-1加入各试剂。