高效液相色谱法测定水体中的苯酚和α-萘酚
一、实验目的
1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；
2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及α-萘酚。

二、实验原理
1、色谱法的分离原理
溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。

2、高效液相色谱仪使用原理
高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

3、苯酚及α-萘酚的分离原理及标准溶液准备
对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利用保留值定性。

保留值的大小取决于分配系数之比，即与组分的性质、固定液的性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。

在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量，这种方法称为校正曲线法。

通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系统误差。

本实验，苯酚的波长为270nm，α-萘酚的波长为295nm。

使得两种物质
的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。

分别配置单样和混合液浓度为100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L标准溶液，分别进样，记录保留时间和出峰面积，用于定性分析。

绘制标准曲线，用于定量分析，计算出样品浓度。

三、实验仪器和药品
高效液相色谱仪；流动相过滤器；超声波清洗器；分析天平；
100 mL容量瓶3个、250 mL容量瓶、200 mL量筒、滴管、100 μL-1000 μL 移液枪、20 μL-200 μL移液枪；
苯酚、α-萘酚、乙腈、蒸馏水。

四、实验步骤
1、开机前准备工作
查资料，确定流动相的比例，一般选用甲醇、水、乙腈按比例配制之后根据需要选择不同的滤膜，对流动相进行抽滤除杂质；再进行超声脱气泡10~20min；配制样品和标准溶液，必要时也用0.45μm滤膜过滤。

2、开机
（1）开启计算机，运行Bootp Serve程序。

（2）依次开启仪器各模块电源。

（3）待各模块自检完成后，设定参数。

菜单栏单击control→monitor instrument，单击Pump图标，出现参数设定菜单，设定Flow 1.0 mL/min，单击Pump off变为Pump on；单击Light图标后，单击Light off 变为Light on；关闭菜单栏。

3、在线检测
（1）在工作界面，选择通道，填写实验信息，在方法菜单栏上点击采样控制，设置采样时间、文件保存路径、保存方式、文件名。

（2）在方法菜单栏点击积分，选择积分参量、积分方法、样品重量、积分最小面积，时间参数等相关参数后点击“采用”按钮。

（3）在方法菜单栏点击谱图显示，设置时间显示范围、电压表示范围、谱图显示颜色、数据显示内容，点击“采用”按钮。

（4）在方法菜单栏点击仪器信息，输入相关仪器参数。

（5）在通道菜单栏点击数据采集，观察流动相基线是否平稳待，基线平稳，在检测器通过“zero”键调零。

标样谱图：用进样针抽取相应量标品，把手动进样器扳钮按逆时针方向旋至“load”处，将进样针插入进样孔，注入标液，注完将进样器扳钮按顺时针方向旋至“inject”处，同时点击外带按钮或数据采集菜单栏“采集数据”按钮。

数据采集完毕，自动积分，文件存于相应地址。

样品谱图：在方法菜单栏点击组分表，在对话框点击谱图按钮，调入标样谱图，通过鼠标拖动圈住对应峰，设定相关参数，点击采用按钮，用进样针抽取相应量样品，进样方式同标样。

点击采集按钮，采集时间结束，文件存于设定地址。

4、分析色谱图
在住界面点击Reprogress进入界面后双击右侧图标后，打开文件，点击所保存的文件名既看到图谱。

点击▓（analysist）显示保留时间和峰面积，记录数据做标准曲线。

计算标准线性方程；待测样品进样后，记录相同保留时间下的物质峰面积，代入方程计算含量。

5、关机
试验结束后用纯甲醇将色谱柱冲洗干净，一般用纯甲醇冲洗1~3h，待记录仪上无杂质峰后关机，关闭稳压电源。

五、实验结果
浓度（mg/L）苯酚保留时间
（min）
苯酚峰面积
（mv）
α萘酚保留时
间（min）
α萘酚峰面积
（mv）
5 5.870 10885 17.817 11832 10 5.885 20712 17.843 22597 20 5.838 3952
6 17.810 42753 40 6.393 85953 19.472 84744 60 6.395 132342 19.53 111818 80 6.37
7 201670 19.12
8 211266 100 6.263 218933 19.343 249168 样品
绘制苯酚、α萘酚标准曲线。

六、注意事项
1. 流动相的制备要与装置相适应，必须经过过滤、脱气并恢复到室温后使用，以防气泡的产生；
2. 样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损；
3. 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力，再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏；
4. 为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。

通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗；
5. 输液泵的压力必需稳定，才能取得良好的分析结果。

变动的幅度大致在0.5MPa以内范围为正常；
6. 在一段时间内不进行分析时，建议清洗柱子，并从装置上卸下，种类不同的柱子，清洗的方法也不同，必须按柱的使用说明书确认。

存放时，柱内应充满溶剂（甲醇或乙腈），两端要封死。

柱子要轻拿轻放。

七、附高效液相色谱法分析谱图
思考题
1、采用色谱法原理的分析仪器有哪些？
2、高效液相色谱法还可以对环境中的哪些污染物质进行分析检测？。