从事一项基因工程，通常总是要先获得目的基因，倘若基因的序列是已知的，可以用化学方法合成，或者利用聚合酶链式反应（PCR）由模板扩增。

此外，最常用并且无需已知序列的方法是建立一个基因文库或cDNA文库，从中选择出目的基因进行克隆。

（一）基因文库的构建
基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。

在理想条件下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。

通常包含以下五个步骤：
1．染色体DNA的片段化：利用能识别较短序列的限制性内切酶对染色体基因组进行随机性切割产生众多的DNA片段。

2．载体DNA的制备：选择适当的λ噬菌体载体，用限制性内切酶切开，得到左右两臂，以便分别与染色体DNA片段的两端连接。

3．体外连接与包装：将染色体DNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接，然后重组体DNA与λ噬菌体外壳蛋白在体外包装
4．重组噬菌体感染大肠杆菌：重组噬菌体感染细胞将重组DNA导入细胞，重组DNA在细胞内增殖并裂解宿主细胞，产生的溶菌产物组成重组噬菌体克隆库，即基因文库。

5．基因文库的鉴定、扩增与保存：构建的基因文库应鉴定其库容量，需要时可进行扩增。

构建好的基因文库可多次使用。

（二）cDNA文库的建立
真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。

真核生物由于外显子与内含子镶嵌排列，转录产生的RNA须切除内含子拼接外显子才能最后表达，因此真核生物的基因是断裂的。

真核生物的基因不能直接在原核生物表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），再接上原核生物的表达控制元件，才能在原核生物中表达。

还有，mRNA 很不稳定，容易被RNA酶分解，因此真核生物须建立cDNA文库来进行克隆和表达研究。

所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

建立cDNA文库与基因文库的最大区别是DNA的来源不同。

基因文库是取现成的基因组DNA，cDNA文库是取细胞中全部的mRNA经逆转录酶生成DNA（cDNA）（图8-1-10），其余步骤二者相类似。

构建cDNA文库的基本步骤有5步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA （质粒或λ噬菌体）；④双链cDNA的克隆（cDNA与载体的重组）；⑤cDNA文库的鉴定、扩增与保存。

（三）基因库中克隆基因的挑选分离
基因文库和cDNA文库建立起来后，下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆，这是一件难度很大，费时费力的工作。

一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体（参见图8-1-3），这种方法叫做“选择”；另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查，这种方法叫做“筛选”。

1．原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十分灵敏而且快速的方法
用于杂交的探针可以是双链DNA，也可以是单链DNA，或是RNA。

杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。

显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。

探针的获得有如下方法：
①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。

②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以用同源序列做探针。

③如果目的基因未知，但知道它对应的蛋白质序列，可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。

2．扣除杂交法：这是一种筛选方法，难度很大，是面对目的基因未知，同源基因未知，蛋白质序列未知的情况的。

基本原理是找到该基因的高表达细胞，提取相应的mRNA，并与一般细
胞提取的mRNA进行比较，分离一般细胞不存在而高表达细胞存在的mRNA，然后用该mRNA逆转录生成cDNA。

（四）聚合酶链式反应扩增目的基因
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是DNA体外酶促扩增，故又称无细胞分子克隆。

它模仿体内DNA反复复制的过程，用DNA聚合酶在体外合成DNA。

1985年由Mulis K发明。

PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段，能在实验室里的一支试管内，将所要研究的一个目的基因或某一DNA片段，在数小时内扩增至百万乃至千百万倍，使得皮克（pg）水平的起始物达到微克（μg）水平的量。

只要一根毛发、一个精子、一滴血的DNA样本，或福尔马林固定、或石腊包埋、或冷冻数万年的组织，都可用于基因结构的分析。

PCR现已成为生命科学实验室获取某一目标DNA片段的一种常规技术，已广泛地应用于医疗工程、生物工程、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医学和考古学等领域.
1．基本原理
PCR方法模拟体内的DNA复制，首先加热使DNA双链变性为单链，然后退火（降温）至变性温度点以下，单链DNA与加入的小片段DNA引物复性，随后适宜温度下在耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）作用下自引物延伸子链。

不断重复高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，使样品DNA大量扩增。

2.PCR的反应条件
①模板DNA（需扩增的目的基因或序列）；
②2种不互补的DNA片段引物；
③4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）；
④耐热DNA聚合酶；
⑤缓冲液。

3．温控
反应开始时94℃加热5～10min使DNA完全变性，然后进入循环。

每一轮循环包括：
①加热，94℃，45s，高温促使DNA变性成单链；
②退火，55℃，1min，使单链DNA与引物粘合；
③延伸，72℃，1～1.5min，Taq DNA最适温度促使DNA子链自引物延伸。

最后一次循环时延伸时间延长到10min，促使所有子链充分延伸。

最后通过电泳分离进行分析。

4．应用
①在分子生物学的一些应用：产生大量已克隆化双链DNA中的特定序列，从少量mRNA生成cDNA文库，选择性扩增特定的cDNA区段，生成大量单链DNA进行序列测定，构建突变体和重组体等。

②在细菌类疾病诊断中的应用：分枝杆菌、淋球菌DNA检测。

③对病毒类疾病诊断中的应用：人类巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒的检测。

④在遗传疾病诊断上的应用：PCR已有效地应用于诊断单基因疾病及产前诊断和携带者的检测。

第一个应用PCR进行产前诊断的疾病为镰刀形红细胞贫血症。

目前，国内外许多单位采用此法来诊断多种遗传性疾病。

如镰刀形红细胞贫血、地中海贫血、血友病A、血友病B、Duchenne肌萎缩、囊性纤维变性、神经纤维瘤、成年多囊肾、视网膜母细胞瘤等。

⑤在肿瘤诊断上的应用：与人类肿瘤相关基因研究最多的为ras基因族，ras基因族包括H- ras、K- ras及N- ras三类基因，该族基因的第12、13及61位密码最易发生点突变，以后便获得了转化潜能，产生ras癌基因。

具转化潜能的ras基因广泛存在于多种肿瘤细胞系，有时也存在于人的肿瘤组织内。

根据这三类基因的DNA顺序，设计引物，将包括点突变部位
的DNA进行PCR扩增，再根据正常的顺序及可能发生突变的顺序设计合成并成多种探针，用标记的探针与PCR扩增DNA杂交，即可判断是否有突变。

⑥在法医物证学上的应用：种属鉴定、性别鉴定、个人识别、亲子鉴定。

⑦在器官移植上的应用：器官移植是治疗重要器官晚期实质性病变所致功能衰竭的最好办法。

目前，常进行移植的重要器官有骨髓、肾、心、胰、肝等。

成功的器官移植受者能够接近正常人一样地生活和劳动。

器官移植的成功与否，关键的问题之一是宿主对移植器官是否产生排斥反应，以及反应的强度。

因此，实现器官移植的一项重要内容就是进行人的组织相容性系统的测定。

目前流行的测定HLA的方法主要是血清学方法和细胞学方法。

但是，这两种方法均有操作繁琐、材料来源困难、保存要求高、花费时间长等缺点。

而且，以上述方法，HLA 的某些等位基因仍无法检测。

PCR技术的建立和发展，使得对HLA基因进行直接测定成为可能。

它能直接作基因分型，具有操作简单、方便、快速、灵敏等特点，而且不会受抗HLA血清和活淋巴细胞等方面的限制，对器官库的建立将提供十分有用的技术手段。

（五）获得目的基因的其他方法
如果基因序列完全已知，可以通过化学方法进行人工合成。

通过定位诱变也可以获得突变基因。