接上人工接头 粘性末端
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
生命科学学院一、 基因组DNA的构建(三)基因组DNA构建的程序 3.载体与基因组DNA大片段的连接 （3）同聚物加尾
末端转移酶 CCC CCC
粘性末端
生命科学学院一、基因组DNA的构建(三)基因组DNA构建的程序 4.重组DNA转化受体细胞
＝1.1 ×103
= 6.9 ×105
这个例子说明用质粒载体（插入片断5-1大承载能力的载体。
生命科学学院一、基因组DNA的构建基因组应具有的克隆子数
基因组大小/bp
克隆片段 平均大小 （bp）
2×106（细菌）
5’
cDNA第一链
cDNA第二链
3’
生命科学学院二、 cDNA构建去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有 用的序列被切掉！）。
5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链
核酸酶S1 5’ 3’
cDNA第一链
cDNA第二链
3’
5’
生命科学学院二、 cDNA构建1．自身引导法克隆片段易于从载体分子上完整卸下。
重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。
生命科学学院一、 基因组DNA的构建( 三)基因组DNA构建的程序 1.载体DNA的制备； 2. 高纯度大相对分子质量基因组 DNA 的提取和大片段 的制备；
3. 高纯度大相对分子质量基因组 DNA 的部分酶切与脉
冲电泳分级分离； 4.载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 5.重组克隆的挑选和保存。
ScaI
Amp R
pBR322
(4.36 kb) Ori
SalI
Tc R
总DNA
MboI
BamHI
P 脱磷酸化 HO OH OH
T4 连接酶
该法简单、快 速、易于操作，但 仅适合一些低等真 核生物和原核生物。
EcoRI HindIII
PstI ScaI
Amp R
重组DNA
Ori
的序列过多或过少。
生命科学学院一、基因组DNA的构建(五)DNA的保存 3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生 素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入
第五章 目的基因的获得
生命科学学院
第五章 目的基因的获得
对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达
数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列
及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此， 单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例
外，绝大多数基因难以直接分离得到。
生命科学学院一、 基因组DNA的构建生命科学学院一、 ，以减轻筛选工作的压力。 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔 克隆。 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利 克隆排序。
生命科学学院二、 cDNA构建基因由外源DNA片段、载体和宿主组成。
生命科学学院
第五章 目的基因的获得
生命科学学院一、 基因组DNA的构建(一)基因组DNA的类型
根据所选用的载体可以分为：质粒 噬菌体 粘粒 人工染色体 载体能够容载的隆数 400 200 100 50 实际克隆 数 1831 919 458 278
2×107 （真菌）
理论克隆 数 4000 2000 1000 500 实际克隆数 18418 9208 4603 2300
2×109（动物）
理论克隆数 600000 300000 150000 75000 实际克隆数 2763110 1381550 690774 345 386
生命科学学院一、 基因组DNA的构建用λ噬菌体载体构建基因组文库的流程
生命科学学院一、 基因组DNA的构建用黏粒载体构建基因组的流程
生命科学学院一、 基因组DNA的构建用酵母人工染色体构建基因组70 oC或-25 oC下保
存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大
生命科学学院二、 cDNA构建真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质
和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用 电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这 是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要 困难。
反转录酶
5’
Oligo dT引物
生命科学学院二、 cDNA构建降解mRNA模板 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的 mRNA。
mRNA 5’
3’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 5’
3’
3’ 5’ 引物
mRNA cDNA第一链 碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
生命科学学院
生命科学学院一、基因组DNA的构建生命科学学院一、基基因组DNA总长/DNA插入 片段的平均长度。
例如：
细菌基因组DNA总长度=3 × 106kb 酶切后b= 2 × 105个 克隆
生命科学学院一、基因组DNA的构建(四)基因组的大小 （必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任 何碱基序列。） 经验值： Ln(1 – P)A片段的出现概率 f—插入片段大小与基因组DNA大小比值
生命科学学院（细菌人工染色体、酵母人工染色体等）载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb
生命科学学院一、 基因组DNA的构建EcoRI HindIII BamHI PstI用质粒载体 构建基因组 的流程二、 cDNA构建
(一) cDNA基因构建的步骤 3. cDNA第二链合成（自身引导法和臵换合成法） 剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链 发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引 物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’ cDNA第一链 cDNA第二链合成 DNA聚合酶
基因特异性、 器官特异性、 代谢或发育特异性
生命科学学院二、 cDNA构建(一) cDNA基因构建的步骤
1. 细胞总RNA的提取和mRNA的分离
2. 第一条cDNA合成 3. 第二条cDNA合成 4. 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中 繁殖
生命科学学院二、 cDNA构建生命科学学院一、 基段低熔点琼脂糖回收
生命科学学院一、 基因组DNA的构建(三)基因组DNA构建的程序 3.载体与基因组DNA大片段的连接
直接连接、人工接头或同聚物加尾。 （1） 粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有 相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。 （2）人工接头法（adapter） 人工合成段与适当 的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后 得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，3’ 5’ mRNA
5’
引物
cDNA
反转录酶
3’
cDNA library 利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与 载体连接，NA构建cDNA的特点（1）不含内含子序列。
（2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达 型的）。 （3）包含特异性，也有组织特异性。
5×103 10×103 20×103 40×103
生命科学学院一、基因组DNA的构建(五)DNA的保存 1、影印膜滤保存法
生命科学学院一、基因组DNA的构建(五)DNA的保存 2.液体培养基中扩增保存 方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生 素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物
mRN步骤
1.总RNA（total RNA）提取和mRNA的分离纯化 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。 mRNA的分离纯化 （1）原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总 RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 （2）mRNA的分离纯化 Column（柱） 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。
高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定 时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有15%左右的基因得
以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由 mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组 克隆简单得多。
生命科学学院二、 cDNA构建cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
生命科学学院二、 cDNA构建mRNA的分离纯化生的步骤 1.cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一 链。
3’ AAAAAAA TTTTTTT cDNA
mRNA
（1）根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞 常见的宿主细胞： DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制 型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互 补。 HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高 JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌 JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌 MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算 ln( 1-0.99)
N E.coli=
ln[1-(2×104/4.6×106)]
Nhuman= ln(1-0.99) ln[1-(2 ×104/3 ×109)]
为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增， 增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因
往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所
有的出来，最后分离得到目的
基因。
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第五章 目的基因的获得