2. 基本程序
PCR排管
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP 引物
预变性
Buffer Mg2+
94℃ 5min
模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer Mg2+
72 ℃ 5～7 min
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
循环25～35次
1.合理分隔实验室 将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注 意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。 2.吸样枪 由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘 上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要 十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸 ，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 3.试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以 减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存。 4.防止操作人员污染 一次性手套、吸头、小离心管应一次 性使用。
粘性末端的线性载体
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
体外连接 获得目的基因的克隆
五、PCR的类型
1 、不对称PCR 2 、反向PCR (reverse PCR) 3 、多重PCR（复合PCR） 4、 LP-PCR（Labelled primers) 5 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 6 、PCR固相分析法 7 、原位PCR 8 、反转录PCR（RT-PCR) 9、 荧光定量 PCR（real-time PCR)
二、 PCR技术的原理
1. PCR技术
在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模 板DNA,四种脱氧核苷酸, 耐热性DNA聚合酶, 一对 合成DNA的引物,通过高 温变性、低温退火和中温 延伸三个阶段的循环合成 DNA，每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大 一倍。一般样品经过30次 循环,可使基因的拷贝数 达到数百万。
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三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
四、PCR法获取目的基因
1. T载体克隆PCR获取的目的基因
具有3‘-5’ 外切酶活性的DNA 聚合酶（如pfu聚合酶），其 扩增的PCR 产物是平末端, 要对这种平末端的PCR 产物进 行克隆, 应首先对PCR产物的3‘末端进行加A的工作。工作 程序如下
方案一 胶回收平末端 PCR产物，进入5µl 10×Tag DNA Polymerase Buffer、4种 dNTP或dATP（终浓度为200nM）、2.5U Tag DNA Polymerase，加水至 终反应体积为 50µl，72℃ 保温10min，纯化 PCR片段后进行TA克隆
PCR法获取目的基因
PCR技术的定义及其发展历史 PCR技术的原理 PCR的反应体系和条件 PCR法获取目的基因 PCR技术的未来展望
PCR技术
多聚酶链式反应
(Polymerase Chain Reaction)
PCR技术即多聚酶链式反应，又称聚合酶 链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或 RNA的方法。
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平 台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。 （6）延伸补齐：72 ℃ 5 min—10 min
PCR技术的注意事项
方案二 PCR 反应（50µl 反应体积）结束以后，加入1µl 200min ，然后进行直接进行TA克隆
2 .设计酶切位点克隆PCR获取的目的基因
目的基因的PCR片段
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
经限制酶切 割得到粘性 末端
经限制酶切割得到的具有
扩增出 的目标
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
（3）重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA链，而 且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产 物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
在生物学实验中做为基础存在，可以说是 现代分子生物学研究中最重要的技术。
一、PCR技术的创建
1.Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2.1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3.1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 4.1988年，第一台PCR仪问世。 5.1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
PCR原理
（1）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存 在
（2）PCR过程：由变性—复性（退火）--延伸三个 基本反应步骤构成
①变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为 单链；
②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补 配对结合；
③延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在 DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序 列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成 新的DNA链