黄酮测定的研究进展简要：黄酮类化合物（Flavonoids），又称生物黄酮（Bioflavon-oids）或植物黄酮，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，黄酮类化合物有着广泛的生物活性和多种药理活性，比如抗氧化、抗炎、抗诱变、抗肿瘤形成与生长等，特别是近年来关于黄酮在心血管、脑血管、肿瘤等方面的研究已经比较深入，此外黄酮类物质还有低毒性的特点，因此长期以来一直是天然药物和功能性食品研究开发的热点[1]。

关键词：黄铜，含量，测定方法，研究进展前言：黄酮类物质是植物光合作用产生的一种天然有机物。

植物界中分布广泛，主要分布于芸香料、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、菊科等。

根据化学方法定义黄酮类物质为含一个共同的苯基苯并二氢吡喃环结构，有一个或多个羟基取代基，包括其衍生物。

在食物中，黄酮类物质一般以酯类、醚类或配糖类衍生物及混合物的形式存在，共有5000 多种化合物。

对于哺乳动物，只能通过饮食获取黄酮物质，这些食物包括水果、蔬菜、谷物、坚果、茶及红酒。

在日常膳食中，黄酮类物质通常表现为具有抗氧化性的羟基衍生物形态，显示出多种生物活性，对于一些疾病，例如癌症和心血管疾病，胃和十二指肠的病理性失调，以及病毒和细菌感染的预防和治疗。

此外，类黄酮还被发现有广泛的药物特性，包括抗氧化性、抗过敏、抗病毒及预防糖尿病，对肝和胃的保护，抗病原体及抗瘤活性。

除在医药工业上已广泛应用其生理活性外，目前也将黄酮类物质作为功能食品的添加剂[2] 。

（一）测定黄铜的几种方法1 紫外分光光度法紫外分光光度法具有重复性好、准确、简便、易掌握、不需要复杂的仪器设备, 加之所需试剂便宜易得, 因此该方法应用于测定植物中黄酮含量最为广泛[ 3]。

1.1 直接测定法大多数黄酮类化合物分子中存在桂皮酰基和苯甲酰基组成的交叉共轭体系, 其MeOH 谱200 nm～400 nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带, 峰带I(300 nm～400nm)和峰带Ⅱ( 220 nm～280 nm)[ 4]。

1.2 比色法向供试样品中加入显色剂后测定吸光度以测定其含量, 这种方法称为比色法。

黄酮类化合物分子中若具有3- 羟基、5- 羟基或邻二酚羟基, 易于与金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应, 生成有色金属络合物。

常用于黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al(NO3)3、A1Cl3等,这些络合物作用在光谱上能产生明显的变化, 吸收峰红移, 同时生成的各种Al3+络合物的稳定性不同。

稳定性规律为: 黄酮醇3-羟基>黄酮5-羟基>二氢黄酮5- 羟基>邻二酚羟基>二氢黄酮醇3- 羟基。

其中从邻二酚羟基以后与Al3+形成的络合物不稳定, 加入少量酸水(如HCl)可分解, 使相应光谱紫移, 而前三种络合物稳定, 不能被分解,故加入HCl 后仍表现为相应峰带红移, 可用于定量法测定黄酮含量[ 5]。

1.3 差示分光光度法差示分光光度法简称ΔA法, 使用稍高于样品或稍低于样品的标准作参比, 测量样品和参比间的相对吸光度。

而此相对吸光度又与样品和参比间的浓度差成比例关系, 借差示工作曲线而求出样品的含量[6]。

在黄酮类化合物测定中, 由于叶类植物中含有大量的叶绿素干扰测定, 虽然用石油醚处理样品可除去大量叶绿素, 但由于植物成分的复杂性, 在黄酮类成分主要吸收范围内仍可能有其它成分产生吸收而干扰测定。

差示分光光度法利用样品溶液中黄酮类成分与A1Cl3络合后, 在特征吸收波长处吸光度值发生显著变化, 所测得的络合前后的吸光度差值与样品中黄酮类成分在一定浓度范围内呈线性关系, 而样品中共存的其它组分(如叶绿素)由于在此波长下不发生吸收性质改变, 因而对测定无影响, 可较好解决背景吸收的问题。

而且实验表明, 采用差示分光光度法测定, 当叶绿素含量较低时, 甚至可省略除叶绿素这一步骤, 因而使测定方法更加简便[7]。

1.4 双波长和导数分光光度法双波长法是分光光度法新发展的一种方法。

它可用于测定吸收光谱曲线重达的混合物的含量而不须用解联调研综述92008年第 3 期总第134 期J IANG SU SHI PIN YU FA J IAO立方程, 还可分析高浓度及混浊样品, 其灵敏度和准确度比普通分光光度法好。

在选择波长时, 原则上除了要干扰物有相等吸光度外, 还要求两波长比较接近, 被测组分在该两波长处的摩尔吸收系数相差大些, 这样方法的灵敏度会更高。

如果将上述双波长分光光度计上两个波长尽可能指近, 使只相差1～ 2 nm, 并且同时进行扫瞄, 能得到试样一阶导数吸收光谱-吸光度对波长的变化率曲线, 即导数分光光度法。

2 薄层扫描法薄层扫描法(TLC- Scanning method)亦称薄层光密度法(TLC- Densitometry),是薄层色谱技术与光密度计和微型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。

薄层扫描法是将样品先经薄层分离后, 然后用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描, 用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。

应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定, 简便快速、灵敏准确、专属性好。

近年来利用薄层扫描法定量测定植物中黄酮成分的研究很多[8]。

3 高效液相色谱法高效液相色谱法是在液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术, 并加以改进而发展起来的一种重要的分离分析方法, 具有分离效能高, 分析速度快, 灵敏度高等特点。

高效液相色谱法在使用中, 以C18柱与C柱最为常用, 柱内填充粒径以10、 5 um用的最多。

由于黄酮类化合物常带有酚羟基, 在水中会部分解离, 而未解离的羟基与固定相作用较强, 从而导致拖尾, 所以黄酮类的反相高效液相色谱( RP- HPLC)中需要加入酸来调节pH 值以抑制解离、克服拖尾现象[9]。

自高效液相色谱法应用于黄酮类的分析以来, RP- HPLC一直扮演着中心角色, 流动相以甲醇-水、乙腈-水体系应用最为广泛。

4 荧光光度法利用黄酮类化合物与某些金属离子的络合物在紫外线照射下可产生荧光, 在一定条件下, 荧光强度与该物质的浓度成正比的性质可建立黄酮类化合物的荧光光度法。

这种测定法尚不多见, 已知桑色素用于铍的荧光光度测定有很高灵敏度。

当黄酮分子中具有3- 羟基(或5- 羟基)时, 可与Al3+、铍等离子配位络合显色, 成为荧光光度法测定黄酮类化合物的基础。

桑色素常被用作黄酮类化合物荧光光度测定法的标准[10]。

5 超临界流体色谱法超临界流体色谱法(Supercritical FluidChromatography, 简称SFC 法)是近年来出现的一种新方法, 在分析领域得到应用[8], 该法在国际上发展很快, 但在我国还处于探索阶段。

刘志敏等采用超临界流体色谱法分离测定了银杏叶提取物水解后的三个苷元—槲皮素、山奈酚、异鼠李素的含量, 以苯基柱为固定相, 二氧化碳- 乙醇- 磷酸为流动相, 三个黄酮苷元获得良好的分离, 利用各苷元的转换因子计算了黄酮化合物的总黄酮的含量; 王学军等建立了超临界流体色谱法同时测定银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的含量, 采用C18色谱柱, 流动相为超临界CO2-0.05%三氟乙酸的乙醇溶液, 检测波长360 nm, 槲皮素和芦丁的平均回收率分别为99.2%和101.3%, RSD分别为2.3%和 2.8%。

超临界流体色谱法定量结果准确, 重现性好。

6 毛细管电泳法毛细管电泳法是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速的电泳分离新技术。

具有柱效高、分离速率快、样品用量少,适用于“脏样品”分析等特点。

毛细管电泳因其电泳迁移技术的差异可分为区带电泳、等速电泳、等电点电泳、凝胶电泳和电动色谱柱电泳 5 种类型。

最普通的分离方式是在溶液中使用单一的缓冲溶液, 即毛细管区域电泳( CZE)。

它的各种操作模式特别是CZE 和胶束电动力学毛细管色谱(MEKC)都能很好的用于植物化学成分含量分析。

（二）国内外研究现状分析黄酮类化合物的主要提取方法是有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波提取法、超临界CO2萃取法、酶浸渍萃取法。

超临界萃取法速度快、操作简单，产品无溶剂残留；超声波辅助提取无需加热，对有效成分具有保护作用。

在提取某些中草药黄酮类成分时，可以将二者合理地结合利用［5］。

测定方法有比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法以及毛细管电泳法。

比色法适于测定总黄酮，但不适用于单一成分的测定。

高效液相色谱是测定黄酮类化合物的有效方法。

它克服了传统定量方法繁琐、费时、分离度欠佳以及GC法的拖尾现象或制成相应衍生物操作繁琐等缺点，分离效率高，在该类化合物中的应用日趋增多。

高效液相色谱-质谱联用法为黄酮类化合物的指纹图谱的建立提供了高效准确的方法。

毛细管电泳以高效、快速、进样量少、节省溶剂、重现性好、不易污染等优点，近几年在黄酮类化合物的分析中得到了较大的发展［5］。

黄酮类化合物具有多方面生物活性:具有降低心肌耗氧量、防治血管硬化等作用，同时也是一种天然抗氧化剂，具有抗衰老、增强机体免疫力、抗癌防癌、调解内分泌系统，护肝抗炎，抗过敏，抑菌，抗病毒等［6］。

如檞皮素、芦丁等具有扩冠作用，水飞蓟宾具有保肝作用［7］。

正是其上述生物活性引起了人们的广泛重视，对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题，是一类具有广泛开发前景的天然药物［8］。

近年来，提取分离黄酮类化合物方面，有很多高新技术的应用：如热反应技术、生物技术、微胶囊包埋技术、干燥技术、膜分离技术、超临界萃取技术、超微粉碎技术、电磁技术以及多种技术的组合，为黄酮类化合物的提取、分离、纯化、分析、鉴定等提供了更为快速准确的实验方法和新的手段思路［9］。

虽然从各种植物中分离、提取了大量的新黄酮类化合物，掀起了黄酮类化合物的研究热潮，但对其吸收、代谢机制、活性机理，具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识。

此外，对黄酮类化合物本身的抗氧化性和其还原产物的毒性，以及该类化合物与摄入量、金属离子催化之间的关系也处于激烈的讨论中［10-11］。

因此，应加强此方面的工作，弄清其生理功能从而以较先进的检测分析手段功能成分进行定性及定量分析，确定这些功能成分的提取工艺。

为黄酮类化合物的进一步开发利用奠定坚实的基础。

参考文献：[1] 罗艺萍. 黄酮类化合物的药理活性研究进展[J]. 亚太传统医药，2010,6(4):126-128[2]高金燕宋永钢毛江华果蔬中黄酮类物质的测定[J] 中国食品添加剂[ 3]王龙, 孙建设.类黄酮的化学结构及其生物学功能[ J] .河北农业大学学报, 2003, 26(5): 145～147.[ 4]姚新生.天然药物化学[M] .北京: 人民卫生出版社, 2001: 184～186.[5]田燕.紫外—可见光谱在黄酮类鉴定中的应用[ J] .大连医科大学学报, 2002, 24(3): 213～215.[ 6]宋用明.差示分光光度法的理论、技术和应用[ J] .中国陶瓷,990, (2): 31～32.[7]严赞开.紫外分光光度法测定植物黄酮含量的方法[ J] .食品研究与开发, 2007, 28(9): 164～165.[8]陈丛瑾, 黄克瀛, 韦龙宾.色谱方法在植物黄酮含量测定中的应用[ J] .光谱实验室, 2007, 24(5): 821～824.[ 9]郭雪峰,岳永德.黄酮类化合物的提取、分离纯化和含量测定方法的研究进展[ J] .安徽农业科学, 2007, 35(26):8083～8086.[10]马陶陶, 张群林, 李俊.中药总黄酮的含量测定方法[ J] .安徽医药,2007,11(11): 1030～1032。