黄酮类化合物提取分离纯化及其活性的研究进展姓名常姣专业微生物学摘要文章综述了黄酮类化合物的结构特征及提取、分离纯化技术介绍了黄酮类化合物的生物活性，并对其开发利用进行了展望。

旨在为黄酮类化合物的研究、开发以及应用提供参考。

关键词黄酮；提取；分离纯化；生物活性民以黄酮类化合物也称黄碱素, 是广泛存在于自然界的一大类化合物, 在植物体内大多与糖结合成甙的形式存在, 也有部分以游离状态的甙元存在。

由于最先发现的黄酮类化合物都具有一个酮式羰基结构, 又呈黄色或淡黄色, 故称黄酮[ 1]。

目前对天然黄酮类化合物的提取方法较多,如溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取分离法及半仿生提取法等, 每种方法都有它各自的优点和点。

用上述方法提取的黄酮类化合物仍然是一个混合物, 不仅是含有其它杂质的粗品, 而且是几种黄酮类成分的混合物, 需进一步分离纯化, 常用的方法有柱层析法、重结晶法、铅盐沉淀法和高效液相色谱法等。

黄酮类化合物具有降低血管脆性及异常的通透性、降血脂、降血压、抑制血小板聚集及血栓形成、抗肝脏病毒、抗炎、抗菌、解栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗癌、防癌、降血糖、镇痛和免疫等生理活性[ 2-5]。

这些生理活性已被关注，对该类化合物的研究成为医药界的热门课题。

人体自身不能合成黄酮类化合物而只能从食物中摄取，因此多年来科学家都在积极研究探讨从植物体中分离纯度高、活性强的黄酮类化合物[6]。

1黄酮类化合物的理化性质黄酮类化合物是以2-苯基色原酮为母核而衍生的一类通过三碳链相互连接而成的大多具有基本碳架的一系列化合物，且母核上常有羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等助色取代基团。

黄酮类化合物多为晶体固体，多数具有颜色，少数（如黄酮苷类）为无定形粉末，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无旋光性) 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态（苷或苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷）不同而有很大差异) 一般游离态苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂) 其中，黄酮、黄酮醇、查儿酮等平面型分子，因堆砌较紧密，分子间引力较大，故更难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面型分子，故排列不紧密，分子间引力降低，有利于水分子进入，水中溶解度稍大。

2黄酮类化合物的提取分离及纯化黄酮类化合物在花、叶、果等组织中多以苷元的形式存在，而在根部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。

因此，不同来源、部位、种类黄酮提取所采取的方法不同[6]。

分离黄酮类化合物的方法很多，根据黄酮类化合物与混入其他化合物的极性不同可采用溶剂萃取法，根据黄酮化合物在酸性水中难溶、碱性水中易溶的特点可采用碱提酸沉法等。

2.1溶剂法2.1.1 热水提取法热水提取法仅能提取黄酮苷类。

金春雪等[ 7]在银杏叶中提取黄酮类化合物, 先取晾干的银杏叶, 加水浸泡24h、大火煮沸30 min ,文火焖蒸30 min ,待稍取上层黄绿液, 蒸发、萃取、过滤即得。

但用水作溶剂浸提黄酮类化合物, 此工艺设备简单、安全、适合于工业大生产, 但提取杂质多, 收率较低, 提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时等缺点[ 8]。

2.1.2 碱性水或碱性稀醇提取法利用黄酮类多含酚羟基的性质, 当在碱性条件下, 其苯基色原酮的, l 2 碳之间的C一O键打开成查耳酮型结构, 此物可溶于水, 当在酸性条件下, 查耳酮又恢复闭环结构, 所以可用碱水提取。

主溶于碱性水( 石灰水、氢氧化钠) 而浸出, 酸化后析出黄酮类化合物, 氢氧化钠水溶液的浸出能力高, 但杂质较多不利于纯化, 石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐, 有利于纯化, 但是浸出效果不如氢氧化钠好,同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质, 不被溶出, 一般可根据不同的原料使用不同的碱性溶液, 丁利君等[ 9]从菊花中提取黄酮类化合物时, 用p H= 10 的氢氧化钠溶液浸出效果较好。

2.1.3 有机溶剂提取法根据黄酮类化合物与杂质极性不同来选择适合的有机溶剂, 常用乙醇、甲醇、水等或某些极性较大的混合溶剂如甲醇:水(1:1)进行提取.一般游离苷元, 难溶或不溶于水, 易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂及稀碱液中, 黄酮苷类易溶于水、甲醇、乙醇等强极性的溶剂中, 故浓度90 % ~ 95 % 的乙醇适宜提取黄酮苷33人参研究RENS H EN Y AN J I U 2009 年第 4 期元, 60 % 左右的乙醇适宜提取黄酮苷类。

许钢等[ 11]用70 % 丙酮提取竹叶黄酮, 提取率达95.5 % .王兰珍等[ 10]用70 % 乙醇冷浸, 从元宝枫叶粉中提取黄酮类化合物, 提取率和黄酮含量都很高, 提取物易于浓缩和干燥。

2.2微波辅助提取法微波提取法是一种外加物理场的方法, 此法在黄酮类物质的提取上也取得了良好的效果, 它在提取过程中, 具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高, 适用于热不稳定物质等特点. 此法多用在药材的浸出上, 浸出过程中药材细粉不凝集、不糊化,克服了热水提取法易凝集易糊化的不足。

刘峙嵘等[12]采用微波萃取杏叶黄酮类化合物, 微波辐射5 min 后抽提1.5h就可以得到较好的效果, 而且利用微波处理, 在短时间内抽提的提取率按鲜银杏叶重计可达到0.536 % ,这是传统工艺提取率的2.2倍。

然而, 微波萃取在理论和实践中还存在一些问题, 如有机溶剂的残留以及微波穿透物质内部时的衰减问题等。

2.3超声波辅助提取法用超声波法提取黄酮类物质, 是目前比较新的方法。

其原理主要是利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成分的浸出。

超声波提取法大大缩短提取时间, 提高有效成分的提取率、原料的利用率。

吴传茂等[13]用超声波振荡法提取大豆和豆豉中的大豆异黄酮苷元, 其提取方法最佳方案是: 样品中加入100% 乙醇300 mL ,超声振荡30 min ,通过检测得出大豆中大豆黄素的含量为106 .5g /g , 染料木黄酮的含量为155.1g/g ; 豆豉中大豆黄素的含量为312.8g/g ,染料木黄酮的含量为555.6g /g 。

2.4超临界流体萃取法超临界流体萃取是利用超临界流体在临界压力和临界温度附近具有的特殊性能作为溶剂进行萃取的一门科学, 最常用的超临界流体为CO2。

应用CO2-SPE技术提取分离黄酮类物质, 具有萃取速度快,效率高, 操作简单等特点, 产品中没有残留有机溶剂,与传统的萃取分离工艺相比优势是明显的。

王正云[14]采用超临界CO2萃取技术对芦笋中的黄酮类化合物进行了萃取研究, 运用L(934)正交表系统研究了萃取压力, 萃取温度, 萃取时间以及夹带剂用量对萃取率的影响。

确定了超临界CO2 萃取芦笋总黄酮的最佳工艺条件为: 温度为70 、时间为2h 、压力为30 MPa 、夹带剂( 75 % 乙醇)用量为2.0 mL/g 。

此条件下得到总黄酮比率为1.35 % , 其黄酮得率是常规溶剂乙醇提取法总黄酮得率的2.7 倍。

2.5酶辅助提取法最近几年,利用酶的特性发展了新的提取方法。

酶解法适用于被细胞壁包围的黄酮类物质, 利用酶反应的高度专一性,破坏细胞壁, 使其中的黄酮类化合物释放出来。

植物细胞壁的主要成分是纤维素, 恰当地利用纤维素酶处理, 可使细胞壁发生不同程度的改变, 如软化、膨胀和崩溃等,从而可改变细胞壁的通透性, 提高黄酮类化合物的提取率, 黄剑波等[15]采用甜茶作材料, 采用纤维素酶辅助的方法, 从中提取黄酮类化合物。

首先, 确定纤维素酶的最佳作用效果, 然后通过单因素实验, 得出酶法辅助的最佳提取工艺为:水做溶剂, 先用40下茶粉质量3%的纤维素酶作用15 min , 再在80下浸提1 h , 固液比为1:30 ,试验结果表明: 黄酮类物质的提取率为91 % , 提取纯度为54 % 。

2.6半仿生提取法半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合, 模拟口服给药后药物经胃肠道转运的环境,为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。

这种提取方法的特点是可以提取和保留更多的有效成分,能缩短生产周期、降低成本。

陈晓娟等[16]通过正交试验优选半仿生法提取杜仲叶中绿原酸和黄酮的工艺条件为: 杜仲叶为原料, 以磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲溶液作为提取液,每次提取1 h ,提取3次,在此条件下,黄酮得率达0.044% 。

2.7双水相提取法双水相提取技术是瑞典PerAlbersson 首先发现并研究的一种技术, 双水相萃取法属于液-液萃取,当物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种力的作用,溶液环境的影响, 其在上、下相中的浓度不同, 即各成分在两相间选择性分配, 从而达到萃取的目的。

由于双水相体系分相快、使用温度低、容易操作、无污染、提取率高, 因此成为黄酮类化合物富集分离的一种有效方法。

张春秀等[13]取一定量的银杏叶浸提液, 加到PEG 1500/磷酸盐体系双水相系统中, 则黄酮类化合物进入上相P EG ,从而将黄酮类化合物分离, 提取率可达98.2 % 。

2.8膜分离法膜分离法主要有超滤、微滤、纳滤和反渗透等,其中超滤法是膜分离的代表,它是惟一能用于分子分离的过滤方法,是以多孔性半透膜为分离介质,依靠薄膜两侧压力差作为推动力来分离溶液中不同分子量的物质。

由于大多数黄酮类化合物的分子量在100034 董宇:黄酮类化合物的提取方法研究及展望以下, 而非有效成分如大多数的多糖、蛋白质等分子量多在50000 以上, 因而使用超滤能有效去除蛋白质、多肽、大分子色素、淀粉等,达到除菌除热原、提高药液澄明度以及提高有效成分含量等目的。

这种方法操作简便、不需要加热、不损坏黄酮类化合物, 提取效果好、超滤装置可反复使用。

于涛等[17]研究了银杏叶中黄酮类化合物的提取过程及工艺, 使用超滤技术对粗提的产品进行精制, 对影响超滤的工艺条件进行了考察,超滤后产品中黄酮质量分数达到33.99 % 。

2.9层析柱法柱层析法是一种常用的有效方法。

其关键是吸附剂的选择。

常用的吸附剂有：聚酰胺、硅胶、吸附树脂（如大孔吸附树脂）、葡聚糖凝胶、活性炭和硅藻土等。

2.9.1 硅胶柱层析硅胶主要适用于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化（或乙酰化）的黄酮及黄酮醇类。

有时加水活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。

硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量有关。

硅醇基能够通过氢键吸附水分，硅胶的吸附力随吸着水分的增加而降低。

洗脱时，常使用混合溶液可由极性较大和极性较小的两种溶剂组成，极性较大的化合物一般用反相硅胶[18]。

2.9.2 聚酰胺柱层析聚酰胺吸附属于氢键吸附，可分离极性物质与非极性物质，对黄酮类化合物的分离有很好的效果。