☐第九章酶应用的基本理论
☐——酶的催化特性与反应动力学
☐第一节酶的催化特性
一、酶催化作用的特点
☐专一性强、效率高、反应条件温和
二、影响酶催化活性的因素
☐温度、pH 、辅助因子、激活剂和抑制剂等
☐酶专一性的确定
☐选择一种酶的作用底物，确定其催化反应的最适温度、pH等反应条件；
☐在最适反应条件下，测定底物浓度对反应速度的影响，确定Km和Vmax；
☐选用与该底物的结构类似的一系列化合物逐个试验，确定该酶属于绝对专一性还是相对专一性；
☐相对专一性的酶，进一步选用几种代表性的底物，求出各自的Km和Vmax，确定最适合的作用底物；
☐采用不同光学异构体的底物进行试验，确定酶是否具有立体异构专一性。
☐第二节酶反应动力学
☐研究酶催化反应速度及其影响因素的学科。
☐酶反应速度：
指酶催化反应的速率，一般用产物增加(或底物减少)的速率表示。
单位：浓度/单位时间。
☐影响酶反应速度的因素：底物浓度、酶浓度、温度、pH、辅助因子、激活剂、抑制剂等。
☐酶反应速度
酶反应速度即曲线斜率，酶反应速度下降的原因：
⏹底物浓度降低
⏹产物浓度升高
⏹产物抑制
⏹部分酶失活
因此研究酶反应速度应以酶反应的初速度为准，即底物转化量<5%时的反应速度。
☐一、动力学数据的获得与分析
☐通过改变酶促反应的外部条件，收集不同条件下酶促反应速度的动力学数据。
☐酶促反应速率的测定方法很多，但在动力学研究中必须选择最方便的方法。
☐确保获得有效数据，p232 六点
☐动力学数据分析
☐结论
☐二、单底物的酶促反应动力学
☐1902年，Henri，在蔗糖酶酶的浓度一定的条件下测定底物（蔗糖）浓度对酶反应速度的影响，它们之间的关系呈现矩形双曲线。
☐2、中间复合物假说
☐1902年，henri（亨利）提出了“酶-底物中间复合体”假说。
☐酶促反应是由酶（E）与底物（S）先结合生成中间复合物（ES）（酶和底物形成中间产物的学说已为实验所证实，且分离到若干种ES结晶），反应迅速而且可逆，然后再慢慢分解成为产物（P），并释放出游离酶。
☐3、快速平衡学说
☐1913年，Michaelis and Menten根据中间复合物学说，建立了快速平衡学说，并提出米氏方程。
☐[S]>>[E]，[ES]分解为产物的逆反应忽略不计
☐4、稳态学说
☐1925年，Briggs and Haldane提出了稳态学说，对米氏方程做出了重要的修正。
☐5、Km和Vmax的求取
☐Lineweaver-Burk双倒数作图法
☐Eadie-Hofstee作图法
☐Hanes-Woolf作图法
☐Eisenthal & Cornish-Bowden
直接线性作图法
☐Lineweaver-Burk双倒数作图法
☐Eadie-Hofstee作图法
☐Hanes-Woolf作图法
☐直接线性作图法
☐7、单底物反应的抑制作用
☐凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。
☐使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。
☐抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
☐ a.非专一性不可逆抑制
☐抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。
☐某些重金属(Pb++、Cu++、Hg++)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基团的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制。
☐用二巯基丙醇或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。
☐ b.专一性不可逆抑制
☐该类抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。
☐有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。
☐(2) 可逆性抑制
☐抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。
☐分为：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
☐ a.竞争性抑制
☐抑制剂I和底物S结构相似，抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。
同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。
☐竞争性抑制剂
☐很多药物都是酶的竞争性抑制剂。
☐例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。
☐由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合
成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。
☐抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。
☐磺胺药物的抑菌作用
☐ b.非竞争性抑制
☐抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。
底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。
☐特点：I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上活性中心结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制。
☐ c.反竞争性抑制
☐反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。
☐反竞争性抑制
☐三种可逆抑制的区别
☐8、pH对酶反应的影响
☐影响酶分子侧链基团的离子化状态，从而改变酶的催化能力
☐pH改变时，酶催化反应的Km和Vmax都会发生变化。
☐酶分子中单一离子化侧链：EH+ E+H+
☐酶分子中存在双解离基团：
☐9、温度对催化反应的影响
☐温度过低，酶促反应速度下降
☐温度过高，酶变性失活
☐在一定温度范围内，随着温度的升高，活化分子数增加，酶促反应速度加快，符合阿累尼乌斯方程。
☐k=A·e。