DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxid e (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。

概述如下表：12工作液外观紫色墨绿色蓝紫色工作液紫外光谱与最大吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50 μg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）200400600800012吸光度波长/nm557nm(50 μg/mL)检测波长 519 nm 734nm557nm （水溶液）检测原理当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。

其清除机制主要是氢转移HAT (hydrogen atom transfer) 当A 734nm 值减少，表明ABTS·+被清除。

其清除机制主要是电子转移ET (el ectron transfer)当A 557减少，表明ABTS·+被清除。

其清除机制主要是电子移ET (electron transfer)加质子转移PT (proton transfer)用途主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

通过调节缓冲液的pH 值，可以检测其抗氧化机制。

优势清除速度较快，约30分钟（室温下）。

清除速度较快，约6分钟（室温下）。

（1）水溶性好，与生物相关性强；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS 清除水平；（3）抗氧化机制明确：pH 值小于5.0时，为电子转移ET 机制。

当调节pH 值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH 值有关，也就是说与氢离子（质子）浓3【实验讲解】1.DPPH•自由基清除实验[1]1.1 DPPH测试液的配置取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

最好避光保存，5小时内用完。

取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。

若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。

1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。

1.3 预试取DPPH溶液1.0 mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。

加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到500 μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500 μL为该样品液的最大用量。

则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL。

A0值：取DPPH溶液1.0 mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5 mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。

A值：取（500-x）μL 有机溶剂到比色皿中，加样品液x μL （x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0 mL，混合使反应液总体积为1.5 mL。

测A值。

【如】某样品的用量梯度为100 μL、200 μL、300 μL 、400 μL、500 μL，则加样如下：样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积0μL 100μL 500 μL400 μL1.0 mL1.0 mL1.5 mL1.5 mL200μL300 μL 1.0 mL 1.5 mL 300μL200 μL 1.0 mL 1.5 mL 400μL100 μL 1.0 mL 1.5 mL 500μL0 μL 1.0 mL 1.5 mL 1.4 最终测量每测一个用量需要测三个平行数据。

1.5 DPPH•清除率（抑制率）的计算4500=100A AA -⨯清除率%(A 0为不加样品时的值；A 为加入样品后的值。

)1.6 使用注意事项 1.6.1 测量前，要先用空白溶剂调零。

1.6.2 将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。

1.6.3 每次使用前后要注意比色皿的清洁。

1.6.4 如果在实验过程中出现A 值大于A 0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A 值(A 本)。

这个A 本值可以通过，加样品但不加DPPH 的方法测得。

此时的计算公式为：00()=100A A A A --⨯本清除率%1.7 疑难解答问：DPPH 实验测量抗氧化性的原理是什么？答：DPPH 法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。

此法是根据DPPH 自由基有单电子，在519nm 处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。

当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。

问：DPPH 自由基被清除的机制是什么？答：DPPH 自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT ），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟基氧杂蒽酮为例）：问：实验中的溶剂应该怎么确定？答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。

值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。

由于1 mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：测量完成后怎么计算IC50答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。

有两种计算方法。

第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。

将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。

第二，通过浓度曲线的图直接读出。

在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：为什么要用Trolox作为阳性对照？答：维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。

不过，维生素E难溶于水，而且易变质。

为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。

Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。

亦称水溶性维生素E。

为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。

另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：为什么会出现清除率为负值的情况？答：样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致A>A0,清除率为负。

问：DPPH•清除率会大于100%吗？答：不可能。

1.8实例茶黄素清除DPPH•67量效曲线图(Microcal Origin 绘制)：D P P H 清除率 %最终浓度 μg/mL82. ABTS·+自由基清除实验[2] 2.1 溶液配制 2.1.1 ABTS 二铵盐储备液(7.4 mmol/L)：取ABTS 二铵盐 3 mg ，加蒸馏水0.735mL 。

（MW ＝548.7） 2.1.2 过二硫酸钾（K 2S 2O 8）储备液(2.6 mmol/L)：取K 2S 2O 8 1mg ，加蒸馏水1.43 mL 。

（MW ＝270.32） 2.1.3 取0.2mL ABTS 二铵盐储备液和0.2mL K 2S 2O 8储备液混合，黑暗环境下室温放置12小时，用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸 光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS •+自由基工作液。

（注：也可以用95乙醇或无水乙醇，但必须是原装分析纯试剂，回收或重蒸者均不可用。

） 2.2 样品液的配置 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1 mg/mL 浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO 。

2.3 预试 取ABTS•+自由基工作液0.8 mL ，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。