基因工程综合实验报告
A型产气荚膜梭菌α毒素基因克隆及表达
班级生物工程081班
姓名盖雪
学号08771029
指导教师高凤山
实验时间2011.10.10-10.14
成绩
一、实验原理
二、主要试剂
DNA Ligation Kit Ver.2.0; Eco RI、Bam HI限制性内切酶；含15%甘油的
0.1mol/L CaCl2，20-30mL。

无菌;0.1mol/L CaCl2 , 20-30mL ；50%甘油（无菌，保存菌种用，50mL）4×25mL LB液体培养基(现配现用)，卡那霉素（Kan）100mg/mL配2mL（过滤），X-gal 二甲基甲酰胺配成20mg/mL 配2mL; IPTG 24mg/mL, 配2mL（需过滤）;蛋白Marker; 0.5M EDTA,pH8.0; 溴化乙锭溶液(EB) （贮存浓度：10mg/mL，使用浓度0.5µg／mL）
三、仪器设备
紫外成像系统，高速冷冻离心机，恒温震荡培养箱，高压灭菌锅，冰箱，水浴锅，微波炉，电炉子，试管架，tube 架，试管，瓶塞，锥形瓶，胶板，电泳槽（包括琼脂糖凝胶和SDS-PAGE），电泳仪，培养皿，移液枪，枪头（各种规格），玻璃涂棒，记号笔，标签纸，卫生纸，水漂（水浴用），试纸，称量纸，一次性手套，酒精灯，火柴，药勺，搅拌子，量筒，烧杯，镊子，tip, tube(1.5mL, 2mL) 五、实验步骤
(一)准备工作
LB培养基配制；LB固体培养基配置；接菌（制备感受态用）
1）LB固体配制
配制固体培养基100mL
加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4，121℃灭菌20min。

灭菌结束后，待温度降至80℃以下时，方能取出，在超净台上，当培养基凉至50-60℃时，迅速加入Kan 30μL（若氨苄，加100ul），摇匀，倒板(4个)。

凝固后放入4℃冰箱。

2）LB液体配制
配制100mL液体LB培养基
加入蒸馏水100mL溶解，用2mol/L NaOH调pH值至7.4。

然后分装，每管5mL，每人分装2管，一共12管；另外分装30mL LB与三角瓶中，余下的LB在原三角瓶中与试管等一起高压，121℃，20min。

高压后，将剩余三角瓶中的LB分装至1.5mL tube中，每管800μL LB (共10个)。

在时间允许的情况下，将高压后的LB试管加入卡那，每管1.5μL。

总结：需要灭菌的东西-液体培养基（试管、30mL三角瓶及剩余液体LB的三角瓶）-固体培养基、离心管（至少30个）、各种规格的枪头。

3）接菌
下午，接种BL21感受态于1管5mL培养基中，37℃震荡培养。

（二）感受态细胞制备、转化、重组菌接种
1）感受态细胞的制备
1.从大肠杆菌DE3平板上挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基的试管
中，37℃振荡培养过夜。

2.取0.6mL菌体转接到含有30mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2
小时。

测定菌体的OD600，当数值位于0.4-0.5之间时，取出。

3.将菌液转移到2mL离心管中，冰上放置10min。

4.离心10min(4000r/min)，回收细胞。

5.倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。

6.用冰冷的0.1mol/L CaCl2约500μL悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min。

7.0-4℃ 4000r/min,离心10min，回收细胞。

8.用冰冷的含有50%甘油的0.1mol/L CaCl2200μL悬浮细胞，（务必放在冰上）。

然后-80℃保存于冰箱。

2）转化步骤
1.取1μL质粒，加入到200μL的感受态细胞中，混匀，冰上放置30min
2.将管放到42℃热激90sec
3.结束后冰浴2min
4.每管加800μL的LB液体培养基，37℃培养1h(慢摇)
5.将适当体积（100μL）已转化的感受态细胞涂在含有氨苄素（30ug/mL）的培
养基上
6.倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落
3）接种重组菌接种一管，加5 L即可。

（三）提取质粒、制备琼脂糖凝胶、电泳
1) 提取质粒步骤
1.将5mL LB液体培养基加入到试管中，并加入1.5μL 卡那霉素，接种环取菌
（α毒素），37℃振荡培养过夜。

2.取1mL培养物倒入微量离心管中，6000r/min离心2min。

3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4.将细菌沉淀悬浮于100μL SolutionⅠ中，充分混匀，冰上放置10min。

5.加入200μL SolutionⅡ，盖紧管口，颠倒数次（10-20次）使混匀。

冰上放置
2min。

6.加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷), 盖紧管口，温和颠倒数次，使混匀。

冰上放置
2min。

12000r/min，离心5min，将上清转至另一试管中。

7.向上清中加入等体积酚：氯仿（1∶1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，
离心5min，将上清转移到另一离心管中。

8.向上清加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，室温放置10min，12000r/min离
心5min，倒去液体，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

9.用1mL 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干
或空气中干燥。

10.加入20μL TE缓冲液，其中含有20ug/mL的RNA酶，37℃水浴1h，然后-20℃
保存备用。

2)琼脂糖凝胶制备
1. 稀释50×TAE为1×TAE，1500mL
2. 称取1g琼脂糖，放于洁净的三角瓶中
3. 量取100mL 1×TAE溶解琼脂糖，并放入微波炉中加热2min
4.将梳子和平版洗干净，用纸擦干，将梳子装好，两边均放梳子，共制备两块胶
5.将配好的琼脂糖凝胶缓缓倒入胶槽中，注意不要留有气泡
6.冷却后拔出梳子，将胶放于4℃保存。

3)电泳
1.电泳时，将点样孔置于负极，样品与上样buffer按比例混合，每孔加样质粒2-3μL，然后100V，电泳35min
2.电泳结束后，取出胶，放入含有0.5ug/mL EB的TAE缓冲液中进行染色，30min 后凝胶成像仪下观察。

（四）诱导表达，提取质粒，酶切
1）诱导表达
IPTG，分子量240，配制母液为24mg/mL,
表达需要终浓度，1 m mol/L，则每个5 mL LB中需要50μL IPTG. （20个试管需要IPTG 1mL）
按照1~2%的量接种重组菌于5mL的LB 液体培养基中，接种前要加入Kan，每个管中加入1.5μL的Kan，然后37℃震荡培养，直至菌液OD600达到0.5左右，加入IPTG，每管加入50μL，继续震荡培养5-6小时。

2）酶切
37℃，3h
然后制备琼脂糖凝胶，电泳、照相。

（五）SDS-PAGE
1）配制分离胶
①固定胶板：用1mm 胶条将大小两块玻璃板隔开，用夹子固定。

②配制分离胶 (20mL)
迅速混匀，将分离胶加入到玻璃板之间，液面距小玻璃板顶端约1.5mL 时为止，然后胶上面加入一层双蒸水。

2. 5%浓缩胶的配制（10 mL ）
分离胶凝固后，倾去蒸馏水，用滤纸吸干残液，然后加入混匀好的浓缩胶至小玻璃板顶端，并插入梳子，凝固后小心拔出梳子。

3.样品制备 菌体样品1mL 经12000r/min 离心，沉淀用45μL TE 溶解，然后以加入5μL 10 ×上样缓冲液，并在100℃沸水中加热5min ，取出离心待用。

4.电泳 一孔加10μL 标准蛋白，一孔加样品。

将玻璃板凝胶放入电泳槽中，并在槽中加入电极夜，接通电源，电流调至1mA/孔，当样品进入分离胶时，调节电压使恒压在120V 。

当溴酚蓝移动到离底部约0.5mL 时，切断电源，停止电源。

将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下胶。

移去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色。

5.凝胶用染色液染色2h ，脱色过夜，换保存液保存胶。

四、实验结果
质粒提取
双酶切
SDS-PAGE
五、分析和讨论
1、从图一分析中得出，因为无法看出有目的条带，所以无法确定转化时质粒是否转化进细胞内，可能的原因是转化时的各步操作的时间和手法没有把握好，或者是在点样的时候buffer 混得太少，点样的手法也有问题，或者因为是后染色效果不明显
2、从图二可以看出出现了目的条带，切目的条带的范围在目标范围内，说明质粒成功转化
3、从图三分析中的出，由于我们组没有设置对照组，所以不能明显分辨出是否表达
4、在操作过程中，应该注意在冰上操作，以保持细胞活性
5、转化时要严格按照转化时间进行试验
6、点样的时候注意不要捅破胶
7、先染色比后染色效果好。